HPLC analýza. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Analýza komplexov kadmia v životnom prostredí

VŠEOBECNÝ FARMAKOPSKÝ ČLÁNOK

Namiesto čl. GF XI

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (vysokotlaková kvapalinová chromatografia) je metóda stĺpcovej chromatografie, pri ktorej je mobilnou fázou kvapalina, ktorá sa pohybuje cez chromatografickú kolónu naplnenú stacionárnou fázou (sorbent). Vysokovýkonné kolóny pre kvapalinovú chromatografiu sa vyznačujú vysokým poklesom tlaku na vstupe.

V závislosti od mechanizmu separácie látok sa rozlišujú tieto varianty vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie: adsorpčná, distribučná, iónomeničová, veľkostne vylučovacia, chirálna atď. v súlade s povahou hlavných prejavujúcich sa medzimolekulových interakcií. Pri adsorpčnej chromatografii dochádza k separácii látok v dôsledku ich rozdielnej schopnosti adsorbovať a desorbovať z povrchu sorbentu s vyvinutým povrchom, napríklad silikagélu. Pri distribučnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii dochádza k separácii v dôsledku rozdielu v distribučných koeficientoch látok, ktoré sa majú separovať, medzi stacionárnou (spravidla chemicky naočkovanou na povrch stacionárneho nosiča) a mobilnou fázou.

V závislosti od typu mobilnej a stacionárnej fázy sa rozlišuje chromatografia na normálnej a reverznej fáze. Pri normálnej fázovej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii je stacionárna fáza polárna (najčastejšie silikagél alebo silikagél s naštepenými skupinami NH 2 - alebo CN- a pod.), mobilná fáza je nepolárna (hexán, resp. zmes hexánu s polárnejšími organickými rozpúšťadlami – chloroform, alkoholy a pod.). Retencia látok sa zvyšuje so zvyšovaním ich polarity. Pri chromatografii na normálnej fáze sa elučná schopnosť mobilnej fázy zvyšuje so zvyšujúcou sa jej polaritou.

Pri chromatografii na reverznej fáze je stacionárna fáza nepolárna (hydrofóbne silikagély s naočkovanými skupinami C4, C8, C18 atď.); mobilná fáza je polárna (zmesi vody a polárnych rozpúšťadiel: acetonitril, metanol, tetrahydrofurán atď.). Retencia látok sa zvyšuje so zvyšovaním ich hydrofóbnosti (nepolarity). Čím vyšší je obsah organického rozpúšťadla, tým vyššia je elučná schopnosť mobilnej fázy.

Pri iónovo-výmennej chromatografii sa molekuly látok zo zmesi, disociované v roztoku na katióny a anióny, pri pohybe cez sorbent (katión alebo anión) oddeľujú v dôsledku rôznej sily interakcie iónov, ktoré sa majú stanoviť, s iónovými skupinami sorbentu.

Pri veľkostnej vylučovacej (sietová, gélová permeácia, gélová filtrácia) chromatografii sa molekuly látok oddeľujú podľa veľkosti v dôsledku ich rozdielnej schopnosti prenikať do pórov stacionárnej fázy. V tomto prípade kolónu ako prvé opúšťajú najväčšie molekuly, ktoré sú schopné preniknúť do minimálneho počtu pórov stacionárnej fázy a ako posledné opúšťajú látky s malou veľkosťou molekúl.

Chirálna chromatografia oddeľuje opticky aktívne zlúčeniny na jednotlivé enantioméry. Separácia sa môže uskutočniť na chirálnych stacionárnych fázach alebo na achirálnych stacionárnych fázach s použitím chirálnych mobilných fáz.

Existujú aj iné možnosti pre vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu.

separácia často prebieha nie jedným, ale viacerými mechanizmami súčasne, v závislosti od typu mobilnej a stacionárnej fázy, ako aj od povahy stanovovanej zlúčeniny.

Oblasť použitia

HPLC sa úspešne používa na kvalitatívnu aj kvantitatívnu analýzu lieky v testoch "Autenticita", "Nečistoty", "Rozpúšťanie", "Rovnomernosť dávkovania", "Kvantifikácia". Je potrebné poznamenať, že chromatografia umožňuje kombinovať niekoľko testov v jednej vzorke, vrátane "Autenticita" a "Kvantifikácia".

Vybavenie

Na analýzu sa používajú vhodné prístroje - kvapalinové chromatografy.

Zloženie kvapalinového chromatografu zvyčajne zahŕňa tieto hlavné zložky:

- prípravná jednotka mobilnej fázy vrátane nádoby s mobilnou fázou (alebo nádob s jednotlivými rozpúšťadlami, ktoré sú súčasťou mobilnej fázy) a odplyňovacieho systému mobilnej fázy;

- čerpací systém;

- mixér mobilnej fázy (ak je to potrebné);

- systém zavádzania vzorky (injektor), môže byť manuálny alebo automatický (autosampler);

- chromatografická kolóna (môže byť inštalovaná v termostate);

- detektor (jeden alebo viacero s rôznymi metódami detekcie);

- riadiaci systém chromatografu, zber a spracovanie údajov.

Okrem toho môže chromatograf obsahovať: systém na prípravu vzorky a predkolónový reaktor, systém prepínania kolón, reaktor za kolónou a ďalšie vybavenie.

Čerpací systém

Čerpadlá dodávajú mobilnú fázu do kolóny pri danej rýchlosti. Zloženie mobilnej fázy a rýchlosť prietoku môžu byť konštantné alebo sa môžu počas analýzy meniť. V prípade konštantného zloženia mobilnej fázy sa proces nazýva izokratický a v druhom - gradient. Moderný čerpací systém kvapalinového chromatografu pozostáva z jedného alebo viacerých čerpadiel riadených počítačom. To umožňuje meniť zloženie mobilnej fázy podľa určitého programu pri gradientovej elúcii. Čerpadlá pre analytickú vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu umožňujú udržiavať prietok mobilnej fázy do kolóny v rozsahu od 0,1 do 10 ml/min pri tlaku na vstupe kolóny do 40 MPa. Tlakové pulzácie sú minimalizované špeciálnymi tlmiacimi systémami zabudovanými do konštrukcie čerpadla. Pracovné časti čerpadiel sú vyrobené z materiálov odolných voči korózii, čo umožňuje použitie agresívnych zložiek v mobilnej fáze.

Miešačky

V miešačke sa zo samostatných rozpúšťadiel dodávaných čerpadlami vytvorí jedna mobilná fáza, ak požadovaná zmes nebola vopred pripravená. Miešanie zložiek mobilnej fázy v mixéri môže prebiehať ako pri nízkom tlaku (pred čerpadlami), tak aj pri vysokom tlaku (za čerpadlami). Miešač možno použiť na prípravu mobilnej fázy a na izokratickú elúciu.

Objem mixéra môže ovplyvniť retenčný čas zložiek pri gradientovej elúcii.

Injektory

Injektory môžu byť univerzálne, s možnosťou zmeny objemu vstrekovanej vzorky, alebo diskrétne pre vstreknutie vzorky len určitého objemu. Oba typy vstrekovačov môžu byť automatické („automatické vstrekovače“ alebo „autosamplery“). Injektor vzorky (roztoku) je umiestnený priamo pred chromatografickou kolónou. Konštrukcia injektora umožňuje zmeniť smer toku mobilnej fázy a vykonať predbežné vstreknutie vzorky do dávkovacej slučky určitého objemu (zvyčajne od 10 do 100 μL) alebo do špeciálneho dávkovacieho zariadenia s variabilným objem. Veľkosť slučky je uvedená na jej štítku. Diskrétny dizajn injektora vo všeobecnosti umožňuje výmenu slučky. Moderné automatické vstrekovače môžu mať množstvo doplnkové funkcie napríklad vykonávať funkciu stanice na prípravu vzoriek: miešať a riediť vzorky, vykonávať predkolónovú derivatizačnú reakciu.

Chromatografický stĺpec

Chromatografické kolóny sú zvyčajne nerezové, sklenené alebo plastové rúrky naplnené sorbentom a uzavreté na oboch stranách filtrami s priemerom pórov 2–5 µm. Dĺžka analytickej kolóny môže byť v rozsahu od 5 do 60 cm alebo viac a vnútorný priemer je od 2 do 10 mm. V mikrokolónovej chromatografii sa používajú kolóny s vnútorným priemerom menším ako 2 mm. Existujú aj kapilárne stĺpce s vnútorným priemerom asi 0,3–0,7 mm. Kolóny na preparatívnu chromatografiu môžu mať vnútorný priemer 50 mm alebo viac.

Pred analytickú kolónu môžu byť inštalované krátke kolóny (ochranné kolóny), ktoré plnia rôzne pomocné funkcie, z ktorých hlavnou je ochrana analytickej kolóny. Zvyčajne sa analýza vykonáva pri izbovej teplote, avšak na zvýšenie účinnosti separácie a skrátenie doby analýzy je možné použiť termostatovanie kolóny pri teplotách do 80 - 100 °C. Možnosť použitia zvýšenej teploty pri separácii je obmedzená stabilitou stacionárnej fázy, keďže pri zvýšené teploty jeho zničenie je možné.

Stacionárna fáza (sorbent)

Zvyčajne sa používajú ako sorbenty:

silikagél, oxid hlinitý, používaný v chromatografii s normálnou fázou. Retenčným mechanizmom je v tomto prípade zvyčajne adsorpcia;
silikagél, živice alebo polyméry očkované kyslými alebo zásaditými skupinami. Oblasť použitia - iónová výmena a iónová chromatografia;
silikagél alebo polyméry s danou distribúciou veľkosti pórov (vylučovacia chromatografia);
chemicky modifikované sorbenty (sorbenty s naočkovanými fázami), najčastejšie pripravované na báze silikagélu. Retenčným mechanizmom je adsorpcia alebo distribúcia medzi mobilnou a stacionárnou fázou. Rozsah závisí od typu vrúbľovaných funkčných skupín. Niektoré typy sorbentov môžu byť použité v reverznej aj normálnej fázovej chromatografii;
chemicky modifikované chirálne sorbenty, napríklad deriváty celulózy a amylózy, proteíny a peptidy, cyklodextríny, chitosany používané na separáciu enantiomérov (chirálna chromatografia).

Vrúbľované sorbenty môžu mať rôzny stupeň chemickej modifikácie. Najčastejšie používané vrúbľované fázy sú:

- oktadecylové skupiny (oktadecylsilánový sorbent (ODS) alebo C18);

- oktylové skupiny (oktylsilán alebo C8 sorbent);

- fenylové skupiny (fenylsilánový sorbent);

- kyanopropylové skupiny (CN sorbent);

- aminopropylové skupiny (sorbent NH2);

- diolové skupiny (sorbent diol).

Najčastejšie sa analýza vykonáva na nepolárnych naočkovaných fázach v režime reverznej fázy s použitím sorbentu C18.

Sorbenty s navrúbľovanými fázami, získané na báze silikagélu, sú chemicky stabilné pri hodnotách pH od 2,0 do 7,0, pokiaľ výrobca neurčí inak. Častice sorbentu môžu mať guľovitý alebo nepravidelný tvar a rôznu pórovitosť. Veľkosť častíc sorbentu v analytickej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii je zvyčajne 3–10 µm, v preparatívnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii - 50 µm alebo viac. Existujú aj monolitické kolóny, v ktorých je sorbentom monolit s priechodnými pórmi, ktorý vypĺňa celý objem kolóny.

Vysokú separačnú účinnosť zabezpečuje vysoký povrch častíc sorbentu (čo je dôsledkom ich mikroskopickej veľkosti a prítomnosti pórov), ako aj rovnomernosť zloženia sorbentu a jeho husté a rovnomerné balenie.

Detektory

Vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii sa používajú rôzne metódy detekcie. Vo všeobecnosti sa po chromatografickej kolóne mobilná fáza so zložkami v nej rozpustenými dostáva do detektorovej cely, kde sa jedna alebo druhá z jej vlastností (absorpcia v ultrafialovej alebo viditeľnej oblasti spektra, fluorescencia, index lomu, elektrická vodivosť atď.) sa merajú nepretržite. Výsledný chromatogram je graf závislosti určitého fyzikálneho alebo fyzikálno-chemického parametra mobilnej fázy na čase.

Najbežnejšie detektory vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii sú spektrofotometrické. V procese elúcie látok v špeciálne navrhnutej mikrokyvete sa meria optická hustota eluátu pri vopred zvolenej vlnovej dĺžke. Široký rozsah linearity detektora umožňuje analyzovať nečistoty aj hlavné zložky zmesi na jednom chromatograme. Spektrofotometrický detektor umožňuje detekciu pri akejkoľvek vlnovej dĺžke vo svojom operačnom rozsahu (zvyčajne 190-600 nm). Používajú sa aj detektory s viacerými vlnovými dĺžkami, ktoré umožňujú detekciu na viacerých vlnových dĺžkach súčasne, a detektory na diódovom poli, ktoré umožňujú súčasne registrovať optickú hustotu v celom rozsahu prevádzkových vlnových dĺžok (spravidla 190-950 nm). To umožňuje zaznamenávať absorpčné spektrá komponentov prechádzajúcich cez detektorovú celu.

Fluorometrický detektor sa používa na detekciu fluorescenčných zlúčenín alebo nefluorescenčných zlúčenín vo forme ich fluorescenčných derivátov. Princíp činnosti fluorometrického detektora je založený na meraní fluorescenčného žiarenia absorbovaného svetla. Absorpcia sa zvyčajne uskutočňuje v ultrafialovej oblasti spektra, vlnové dĺžky fluorescenčného žiarenia presahujú vlnové dĺžky absorbovaného svetla. Fluorometrické detektory majú veľmi vysokú citlivosť a selektivitu. Citlivosť fluorescenčných detektorov je asi 1000-krát vyššia ako citlivosť spektrofotometrických. Moderné fluorescenčné detektory umožňujú nielen získavať chromatogramy, ale aj zaznamenávať excitačné a fluorescenčné spektrá analyzovaných zlúčenín.

Na stanovenie zlúčenín, ktoré slabo absorbujú ultrafialové a viditeľné oblasti spektra (napríklad uhľohydráty), použite refraktometrická detektory (refraktometre). Nevýhodou týchto detektorov je ich nízka (v porovnaní so spektrofotometrickými detektormi) citlivosť a výrazná teplotná závislosť intenzity signálu (detektor musí byť termostatovaný), ako aj nemožnosť ich použitia v režime gradientovej elúcie.

Princíp činnosti odparovacie laserové detektory rozptylu svetla na základe rozdielu medzi tlakmi pár chromatografických rozpúšťadiel zahrnutých v mobilnej fáze a analyzovaných látok. Mobilná fáza sa na výstupe z kolóny zavedie do rozprašovača, zmieša sa s dusíkom alebo CO 2 a vo forme jemného aerosólu vstupuje do vyhrievanej odparovacej trubice s teplotou 30 - 160 °C, v ktorej sa mobilná fáza sa odparí. Aerosól neprchavých častíc analytu rozptyľuje svetelný tok v difúznej komore. Podľa stupňa rozptylu svetelného toku je možné posúdiť množstvo stanovenej zlúčeniny. Detektor je citlivejší ako refraktometrický, jeho signál nezávisí od optických vlastností vzorky, od typu funkčných skupín v stanovovaných látkach, od zloženia mobilnej fázy a možno ho použiť v režime gradientovej elúcie. .

Elektrochemické detektory (konduktometrické, amperometrické, coulometrické atď.). Amperometrický detektor sa používa na detekciu elektroaktívnych zlúčenín, ktoré môžu byť oxidované alebo redukované na povrchu pevnej elektródy. Analytický signál je veľkosť oxidačného alebo redukčného prúdu. Detektor obsahuje minimálne dve elektródy – pracovnú a referenčnú elektródu (chlorid strieborný alebo oceľ). Na elektródy sa aplikuje pracovný potenciál, ktorého hodnota závisí od povahy stanovovaných zlúčenín. Merania je možné vykonávať ako pri konštantnom potenciáli, tak aj v pulznom režime, kedy je profil zmeny potenciálu pracovnej elektródy nastavený počas jedného cyklu registrácie signálu. Amperometrický detektor využíva pracovné elektródy vyrobené z uhlíkových materiálov (najčastejšie sklovitého uhlíka alebo grafitu), a kovu: platina, zlato, meď, nikel.

Konduktometrický detektor sa používa na detekciu aniónov a katiónov v iónovej chromatografii. Jeho princíp činnosti je založený na meraní elektrickej vodivosti mobilnej fázy v procese elúcie látky.

Mimoriadne informatívny je hmotnostný spektrometrický detektor, ktorý má vysokú citlivosť a selektivitu. Najnovšie modely hmotnostných spektrometrov pre kvapalinovú chromatografiu pracujú v hmotnostnom rozsahu m/z od 20 do 4000 amu.

Vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii sa využívajú aj Fourierove-IR detektory, rádioaktivita a niektoré ďalšie.

Systém zberu a spracovania údajov

Moderný systém spracovania dát je osobný počítač pripojený k chromatografu s nainštalovaným softvérom, ktorý umožňuje registráciu a spracovanie chromatogramu, ako aj riadenie činnosti chromatografu a sledovanie hlavných parametrov chromatografického systému.

Mobilná fáza

Mobilná fáza vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii plní dvojitú funkciu: zabezpečuje prenos desorbovaných molekúl pozdĺž kolóny a reguluje rovnovážne konštanty, a tým aj retenciu v dôsledku interakcie so stacionárnou fázou (adsorbovanou na povrchu) a s molekulami látok, ktoré sa majú oddeliť. Zmenou zloženia mobilnej fázy pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii je teda možné ovplyvniť retenčné časy zlúčenín, selektivitu a účinnosť ich separácie.

Mobilná fáza môže pozostávať z jedného rozpúšťadla, často dvoch, v prípade potreby troch alebo viacerých. Zloženie mobilnej fázy je uvedené ako objemový pomer rozpúšťadiel v nej obsiahnutých. V niektorých prípadoch môže byť uvedený hmotnostný pomer, ktorý by mal byť špeciálne špecifikovaný. Ako zložky mobilnej fázy môžu byť použité tlmivé roztoky s určitou hodnotou pH, rôzne soli, kyseliny a zásady a iné modifikátory.

Chromatografia na normálnej fáze zvyčajne používa kvapalné uhľovodíky (hexán, cyklohexán, heptán) a iné relatívne nepolárne rozpúšťadlá s malými prídavkami polárnych organických zlúčenín, ktoré riadia elučnú silu mobilnej fázy.

Pri chromatografii na reverznej fáze sa ako mobilná fáza používa voda alebo vodno-organické zmesi. Organické prísady sú zvyčajne polárne organické rozpúšťadlá (acetonitril a metanol). Na optimalizáciu separácie možno použiť vodné roztoky s určitou hodnotou pH, najmä tlmivý roztok, ako aj rôzne prísady do mobilnej fázy: kyselinu fosforečnú a octovú pri separácii kyslých zlúčenín; amoniak a alifatické amíny pri separácii zásaditých zlúčenín a iné modifikátory.

Chromatografickú analýzu do značnej miery ovplyvňuje čistota mobilnej fázy, preto je vhodnejšie použiť rozpúšťadlá špeciálne vyrábané pre kvapalinovú chromatografiu (vrátane vody).

Pri použití UV spektrofotometrického detektora by mobilná fáza nemala mať výraznú absorpciu pri vlnovej dĺžke zvolenej na detekciu. Hranica priehľadnosti alebo optická hustota pri určitej vlnovej dĺžke rozpúšťadla konkrétneho výrobcu je často uvedená na obale.

Mobilná fáza a analyzované roztoky by nemali obsahovať nerozpustené častice a bublinky plynu. Voda získaná v laboratórnych podmienkach, vodné roztoky, organické rozpúšťadlá vopred zmiešané s vodou, ako aj analyzované roztoky sa musia podrobiť jemnej filtrácii a odplyneniu. Na tieto účely sa zvyčajne používa filtrácia vo vákuu cez membránový filter s veľkosťou pórov 0,45 μm inertný vzhľadom na dané rozpúšťadlo alebo roztok.

Zoznam chromatografických podmienok, ktoré treba uviesť

Liekopisná monografia by mala obsahovať: úplný obchodný názov kolóny s uvedením výrobcu a katalógovým číslom, rozmery kolóny (dĺžka a vnútorný priemer), typ sorbentu s uvedením veľkosti častíc, veľkosť pórov, teplotu kolóny (ak je potrebné termostatovanie). ), objem vstrekovanej vzorky (objemové slučky), zloženie mobilnej fázy a spôsob jej prípravy, rýchlosť posuvu mobilnej fázy, typ detektora a podmienky detekcie (v prípade potreby parametre použitého detektora). bunka), popis gradientového režimu (ak sa používa), vrátane štádia opätovného uvedenia do rovnováhy na počiatočné podmienky, času chromatografie, Detailný popis výpočtové metódy a vzorce, popisy prípravy štandardných a skúšobných roztokov.

V prípade použitia predstĺpcovej derivatizácie v autosampleri sú uvedené informácie o programe autosamplera. V prípade použitia postkolónovej derivatizácie sa uvádza rýchlosť dávkovania derivatizačného činidla, objem miešacej slučky a jej teplota.

Modifikované typy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie

Iónová párová chromatografia

Jednou z odrôd vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou je iónová párová chromatografia - ktorá umožňuje stanovenie ionizovaných zlúčenín. Na tento účel sa do zloženia tradičnej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie mobilnej fázy na reverznej fáze pridávajú hydrofóbne organické zlúčeniny s ionogénnymi skupinami (reagencie iónových párov). Na separáciu zásad sa zvyčajne používajú alkylsulfáty sodné, na separáciu kyselín tetraalkylamóniové soli (tetrabutylamóniumfosfát, cetyltrimetylamóniumbromid a pod.). V režime iónových párov bude selektivita separácie neiónových zložiek obmedzená retenčným mechanizmom v reverznej fáze a retencia zásad a kyselín sa výrazne zvýši, pričom sa zlepší tvar chromatografických píkov.

Obmedzenie v režime iónových párov je spôsobené pomerne zložitými rovnovážnymi procesmi, ktoré si navzájom konkurujú. Na jednej strane je v dôsledku hydrofóbnych interakcií a účinku vytesnenia polárneho prostredia mobilnej fázy možná sorpcia hydrofóbnych iónov na povrchu alkylsilikagélu tak, že nabité skupiny smerujú k mobilnej fáze. . V tomto prípade povrch získava iónomeničové vlastnosti a retencia sa riadi zákonmi iónovo-výmennej chromatografie. Na druhej strane je možný vznik iónového páru priamo v objeme eluentu s následnou jeho sorpciou na sorbent mechanizmom reverznej fázy.

Hydrofilná interakčná chromatografia ( HILIC chromatografia)

Chromatografia s hydrofilnou interakciou sa používa na oddelenie polárnych zlúčenín slabo zadržaných vo vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii s reverznou fázou. Ako mobilná fáza v tomto variante chromatografie sa používajú zmesi voda-acetonitril s prídavkom solí, kyselín alebo zásad. Stacionárne fázy sú spravidla silikagély modifikované polárnymi skupinami (amino, diolové, kyanopropylové skupiny atď.). Polárne zlúčeniny sú pevne držané. Elučná schopnosť mobilnej fázy sa zvyšuje so zvyšujúcou sa polaritou.

Iónová výmena a iónová vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

Iónomeničová chromatografia sa používa na analýzu organických (heterocyklické zásady, aminokyseliny, proteíny atď.) aj anorganických (rôzne katióny a anióny) zlúčenín. Separácia zložiek analyzovanej zmesi v iónovo-výmennej chromatografii je založená na reverzibilnej interakcii iónov analyzovaných látok s iónomeničovými skupinami sorbentu. Týmito sorbentmi sú prevažne buď polymérne iónomeničové živice (zvyčajne kopolyméry styrénu a divinylbenzénu s očkovanými iónomeničovými skupinami) alebo silikagély s očkovanými iónomeničovými skupinami. Na separáciu aniónov (anionitov) sa používajú sorbenty so skupinami: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + atď., a sorbenty so skupinami: -SO 3 -, -RSO 3 -, - COOH, -PО 3 - a iné na separáciu katiónov (katexy).

Vodné roztoky kyselín, zásad a solí sa používajú ako mobilná fáza v iónomeničovej chromatografii. Zvyčajne sa na udržanie určitých hodnôt pH používajú tlmivé roztoky. Je možné použiť aj malé prísady organických rozpúšťadiel miešateľných s vodou - acetonitril, metanol, etanol, tetrahydrofurán.

Iónová chromatografia - variant iónovo-výmennej chromatografie, pri ktorej sa na detekciu určovaných zlúčenín (iónov) používa konduktometrický detektor. Pre vysoko citlivé stanovenie zmien vodivosti mobilnej fázy prechádzajúcej detektorom musí byť vodivosť pozadia mobilnej fázy nízka.

Existujú dve hlavné možnosti iónovej chromatografie.

Prvá z nich - dvojstĺpcová iónová chromatografia, je založená na potlačení elektrickej vodivosti elektrolytu mobilnej fázy pomocou druhej iónomeničovej kolóny alebo špeciálneho membránového supresívneho systému umiestneného medzi analytickou kolónou a detektorom. Pri prechode systémom sa vodivosť mobilnej fázy znižuje.

Druhým variantom iónovej chromatografie je jednostĺpcová iónová chromatografia. Tento variant využíva mobilnú fázu s veľmi nízkou elektrickou vodivosťou. Ako elektrolyty sa široko používajú slabé organické kyseliny: benzoová, salicylová alebo izoftalová.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia podľa veľkosti

Veľkostne vylučovacia chromatografia (gélová chromatografia) je špeciálna verzia vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie založená na separácii molekúl podľa ich veľkosti. Rozloženie molekúl medzi stacionárnou a mobilnou fázou je založené na veľkosti molekúl a čiastočne na ich tvare a polarite.

Sú možné dva limitujúce typy interakcie molekúl s poréznou stacionárnou fázou. Molekuly väčšie ako maximálny priemer pórov sa vôbec nezachytia a najskôr sa eluujú, pričom sa pohybujú súčasne s mobilnou fázou. Molekuly s veľkosťou menšou ako je minimálny priemer pórov sorbentu voľne prenikajú do pórov a sú z kolóny eluované ako posledné. Zvyšok molekúl so strednou veľkosťou je čiastočne zadržaný v póroch a pri elúcii sa delí na frakcie podľa ich veľkosti a čiastočne svojim tvarom preniká do pórov sorbentu v závislosti od veľkosti a čiastočne v závislosti od ich tvaru. . V dôsledku toho sa látky eluujú s rôznymi retenčnými časmi.

Iónová vylučovacia chromatografia

Mechanizmus iónovo-vylučovacej chromatografie je založený na efekte, že zlúčeniny v ionizovanej forme nie sú zadržiavané na sorbent-iónomeniči, zatiaľ čo zlúčeniny v molekulárnej forme sú distribuované medzi stacionárnu a vodnú fázu vo vnútri pórov iónomeničový sorbent a mobilná fáza migrujúca v priestore medzi časticami sorbentu. Separácia je založená na elektrostatickom odpudzovaní, polárnych a hydrofóbnych interakciách medzi rozpustenými zlúčeninami a sorbentom.

Aniónové skupiny na povrchu sorbentu pôsobia ako semipermeabilná „membrána“ medzi stacionárnou a mobilnou fázou. Záporne nabité zložky sa nedostanú do stacionárnej mobilnej fázy, pretože sú odpudzované podobne nabitými funkčnými skupinami a eluujú sa v „mŕtvom“ (voľnom) objeme kolóny. Zložky v molekulárnej forme nie sú "odvrhnuté" katexovým sorbentom a sú rozdelené medzi stacionárnu a mobilnú fázu. Rozdiel v stupni retencie neiónových zložiek zmesi je daný kombináciou polárnych interakcií neiónových zložiek s funkčnými skupinami katexového sorbentu a hydrofóbnych interakcií neiónových zložiek s nepolárnym matrice sorbentu.

Chirálna chromatografia

Účelom chirálnej chromatografie je separácia optických izomérov. Separácia sa uskutočňuje na chirálnych stacionárnych fázach alebo na konvenčných achirálnych stacionárnych fázach s použitím chirálnych mobilných fáz. Ako chirálne stacionárne fázy sa používajú sorbenty s povrchom modifikovaným skupinami alebo látkami s chirálnymi centrami (chitosany, cyklodextríny, polysacharidy, proteíny a pod. (chirálne selektory). V tomto prípade môžu byť ako mobilné fázy použité rovnaké fázy ako v normálnych fázová alebo reverzná fázová chromatografia Keď sa na zabezpečenie separácie enantiomérov používajú achirálne stacionárne fázy, do mobilných fáz sa pridávajú chirálne modifikátory: chirálne komplexy kovov, neutrálne chirálne ligandy, chirálne iónové párové činidlá atď.

Ultra výkonná kvapalinová chromatografia

Ultravýkonná kvapalinová chromatografia je variant kvapalinovej chromatografie, ktorý je účinnejší ako klasická vysokoúčinná kvapalinová chromatografia.

Charakteristickým znakom ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie je použitie sorbentov s veľkosťou častíc 1,5 až 2 mikróny. Rozmery chromatografických kolón sú zvyčajne 50 až 150 mm na dĺžku a 1 až 4 mm v priemere. Objem vstreknutej vzorky môže byť od 1 do 50 μl. Použitie takýchto chromatografických kolón môže výrazne skrátiť čas analýzy a zvýšiť účinnosť chromatografickej separácie. Avšak v tomto prípade môže tlak na kolóne dosiahnuť 80 - 120 MPa, požadovaná rýchlosť zberu dát z detektora sa môže zvýšiť na 40 - 100 hertzov, extrakolónový objem chromatografického systému by sa mal minimalizovať. Chromatografické zariadenia a kolóny používané v ultravýkonnej kvapalinovej chromatografii sú špeciálne prispôsobené na splnenie požiadaviek tohto typu chromatografie.

Zariadenie určené pre ultravýkonnú kvapalinovú chromatografiu je možné použiť aj v klasickej verzii vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie.

Kvapalinová chromatografia

Kvapalinová chromatografia je typ chromatografie, v ktorej mobilná fáza, nazývaný eluent, je kvapalina. Stacionárna fáza možno pevný sorbent, pevný nosič s kvapalinou nanesenou na jeho povrchu alebo gél.

Rozlišovať stĺpovitý a tenká vrstva kvapalinovou chromatografiou. V kolónovej verzii časť zmesi látok, ktoré sa majú oddeliť, prechádza cez kolónu naplnenú stacionárnou fázou v prúde eluentu, ktorý sa pohybuje pod tlakom alebo pôsobením gravitácie. Pri chromatografii na tenkej vrstve sa eluent pohybuje pôsobením kapilárnych síl pozdĺž plochej vrstvy sorbentu nanesenej na sklenenú platňu alebo kovovú fóliu, po poréznom polymérnom filme alebo po páse špeciálneho chromatografického papiera. Bola vyvinutá aj metóda tenkovrstvovej kvapalinovej chromatografie pod tlakom, keď sa eluent čerpá cez vrstvu sorbentu vloženú medzi platne.

Existujú také typy kvapalinovej chromatografie ako napr analytické(na analýzu zmesí látok) a prípravný(na izoláciu čistých zložiek).

Rozlišovať kvapalinovou chromatografiou (LC) vo svojej klasickej verzii, uskutočnenej o atmosferický tlak a vysoká rýchlosť) vykonaná o vysoký krvný tlak... Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) využíva kolóny s priemerom do 5 mm, tesne naplnené sorbentom s malými časticami (3-10 mikrónov). Na čerpanie eluentu cez kolónu použite tlak až 3,107 Pa. Tento typ chromatografie sa nazýva vysokotlaková chromatografia... Prechod eluentu cez kolónu pod vysokým tlakom umožňuje dramaticky zvýšiť rýchlosť analýzy a výrazne zvýšiť účinnosť separácie vďaka použitiu jemne dispergovaného sorbentu.

Možnosti HPLC sú mikrokolónová chromatografia na kolónach malého priemeru naplnených sorbentom a kapilárna chromatografia na dutých a sorbentom naplnených kapilárnych kolónach. Metóda HPLC v súčasnosti umožňuje izolovať, kvantitatívne a kvalitatívne analyzovať zložité zmesi organických zlúčenín.

Kvapalinová chromatografia je najdôležitejšou fyzikálno-chemickou výskumnou metódou v chémii, biológii, biochémii, medicíne a biotechnológii. Používa sa na:

Štúdium metabolických procesov v živých organizmoch drogy;

· Diagnostika v medicíne;

· Analýza produktov chemickej a petrochemickej syntézy, medziproduktov, farbív, palív, mazív, ropy, odpadových vôd;

· Štúdium izoterm sorpcie z roztoku, kinetiky a selektivity chemických procesov;

Vypúšťanie

· Analýza a separácia zmesí, ich čistenie a izolácia mnohých biologických látok z nich, ako sú aminokyseliny, bielkoviny, enzýmy, vírusy, nukleové kyseliny, sacharidy, lipidy, hormóny.

V chémii makromolekulových zlúčenín a pri výrobe polymérov sa kvalita monomérov analyzuje pomocou kvapalinovej chromatografie, študuje sa distribúcia molekulových hmotností a distribúcia podľa typov funkcionality oligomérov a polymérov, ktoré sú potrebné pre kontrolu produktu.

Kvapalinová chromatografia sa používa aj v parfumérii, potravinárstve, na analýzu znečistenia životného prostredia, vo forenznej vede.

Metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) bola vyvinutá a zavedená v polovici 70. rokov 20. storočia. Potom sa objavili prvé kvapalinové chromatografy.

Kvapalinová chromatografia je optimálna metóda na analýzu chemicky a tepelne nestabilných molekúl, vysokomolekulárnych látok so zníženou prchavosťou. To možno vysvetliť špeciálnou úlohou mobilnej fázy v LC, na rozdiel od plynovej chromatografie: eluent neplní len transportnú funkciu.

2. Základné pojmy a klasifikácia metód kvapalinovej chromatografie.

Autor: mechanizmus retencie látok, ktoré sa majú oddeliť stacionárnou fázou LC rozlíšiť medzi:

sedimentačná chromatografia

· adsorpčná chromatografia , v ktorom sa separácia uskutočňuje ako výsledok interakcie látky, s ktorou sa má separovať adsorbent ako je oxid hlinitý alebo silikagél, majúci na povrchu aktívne polárne centrá. Solventný(eluent) - nepolárna kvapalina.

Ryža. Schéma separácie zmesi látok adsorpčnou chromatografiou

http://www. xumuk. ru / biologhim / bio / img014.jpg

Sorpčný mechanizmus spočíva v špecifickej interakcii medzi polárnym povrchom sorbentu a polárnymi (resp. schopnými polarizácie) oblasťami molekúl analyzovanej zložky (obr.). K interakcii dochádza v dôsledku interakcie donor-akceptor alebo tvorby vodíkových väzieb.

Ryža. Diagram adsorpčnej kvapalinovej chromatografie

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg "width =" 219 "height =" 200 ">

Ryža. ... Deliaca chromatografia na očkovanej fáze (variant s normálnou fázou).

http://www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

o normálna fáza Vo variante deliacej kvapalinovej chromatografie sa ako modifikátory povrchu silikagélu (štepené fázy) používajú substituované alkylchlórsilány obsahujúce polárne skupiny, ako je nitril, aminoskupiny atď. Použitie očkovaných fáz umožňuje jemné riadenie sorpčných vlastností povrchu stacionárnej fázy a dosiahnutie vysokej účinnosti separácie.

Obrátená fáza kvapalinová chromatografia je založená na rozdelení zložiek zmesi medzi polárny eluent a nepolárne skupiny (dlhé alkylové reťazce) naočkované na povrch sorbentu (obr.). Menej často sa používa variant kvapalinovej chromatografie s nanesenými fázami, keď sa na stacionárny nosič nanesie tekutá stacionárna fáza.

Ryža. ... Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (verzia s obrátenými fázami). http://www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

Deliaca kvapalinová chromatografia zahŕňa extrakčná kvapalina chromatografia, v ktorom je stacionárnou fázou organický extraktant nanesený na pevnom nosiči a mobilnou fázou je vodný roztok zlúčenín, ktoré sa majú separovať. Ako extrakčné činidlá sa používajú napríklad fenoly, trialkylfosfáty, amíny, kvartérne amóniové zásady, ako aj organofosforové zlúčeniny obsahujúce síru. Extrakčná kvapalinová chromatografia sa používa na separáciu a koncentráciu anorganických zlúčenín, napríklad iónov alkalických kovov, aktinoidov a iných prvkov s podobnými vlastnosťami, pri spracovaní vyhoreného jadrového paliva.

iónomeničová chromatografia,

iónomeniče.

katiónové výmenníky

anionity.

amfotérne iónomeniče

amfolyty

Ionit

Výmenník katiónov

anionity

R-H + Na + + Cl - → R-Na + H + + Cl - (výmena katiónov)

R-OH + Na + + Сl - → R-Сl + Na + + OH - (výmena aniónov)

Iónomeniče musia spĺňať nasledovné požiadavky: byť chemicky stabilné v rôznych prostrediach, mechanicky pevné v suchom a najmä napučanom stave, majú vysokú absorpčnú schopnosť a schopnosť dobre sa regenerovať.

Pri iónovo-výmennej (iónovej) chromatografii sa separované anióny (katióny) detegujú ako kyseliny (zodpovedajúce zásady) vysoko citlivým konduktometrickým detektorom, kde sú vysokovýkonné kolóny naplnené povrchovo aktívnym iónomeničom s malou kapacitou.

iónová párová chromatografia

komplexné zlúčeniny

chromatografia na výmenu ligandov

rozdielna schopnosť separovaných zlúčenín vytvárať komplexy s katiónmi prechodných kovov

rozmerovo vylučovacia chromatografia

rozdiely vo veľkosti molekúl

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg "align =" right "width =" 429 "height =" 319 ">

Ryža. Schéma gélovej permeačnej chromatografie

afinitná chromatografia

Ryža. Schéma afinitnej chromatografie

http://www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

Potom sa z polyméru odstráni prechodom roztoku zlúčeniny s ešte väčšou afinitou k makromolekule. Takáto chromatografia je obzvlášť účinná v biotechnológii a biomedicíne na izoláciu enzýmov, proteínov, hormónov.

Záleží na na spôsobe prepravy látky rozlišujú sa tieto možnosti kvapalinovej chromatografie: rozvíjajúce sa, čelné a posunutie.
Najčastejšie používané expresívne variant, v ktorom sa časť zmesi, ktorá sa má oddeliť, zavádza do kolóny v prúde eluentu. Výstup zložiek zmesi z kolóny sa zaznamenáva na chromatograme ako píky. (ryža.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg "width =" 291 "height =" 165 ">

Ryža. Schéma vyvíjacieho variantu chromatografie

Výška alebo oblasť vrcholu charakterizuje koncentrácia komponentov, a držané zväzkov – kvalitatívne zloženie zmesi... Identifikácia komponentov sa zvyčajne vykonáva zhodou retenčných časov so štandardnými látkami, používajú sa aj chemické alebo fyzikálno-chemické metódy.

o čelný Vo variante (obr.) kolónou kontinuálne prechádza zmes separovaných látok, ktorá plní úlohu mobilnej fázy. Výsledkom je, že len látka, ktorá je najmenej sorbovaná v kolóne, môže byť získaná v čistej forme.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg "width =" 279 "height =" 145 ">

Ryža. Schéma frontálnej chromatografie

Chromatogram v tomto prípade predstavuje stupne, ktorých výšky sú úmerné koncentráciám zložiek; retenčné objemy sú určené retenčným časom zložiek. Pri diferenciácii takého chromatogramu sa získa obraz, ktorý je podobný obrazu získanému vo vyvolávacej verzii.

V posunutie V jednom variante sú zložky zmesi zavedené do kolóny vytesnené eluentom, ktorý je adsorbovaný silnejšie ako ktorákoľvek zložka. V dôsledku toho sa získajú susediace frakcie látok, ktoré sa majú oddeliť, Poradie uvoľňovania zložiek je určené silou ich interakcie s povrchom sorbentu (obr.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg "width =" 320 "height =" 175 ">

Ryža. Schéma vytesňovacej chromatografie

3. Základné chromatografické veličiny a ich stanovenie.

Pri separácii látok pomocou kvapalinovej chromatografie sa môžu použiť možnosti vyvolávania, čelnej strany a vytesňovania, ako je uvedené vyššie. Najčastejšie sa používa vyvolávacia verzia, pri ktorej sa časť zmesi, ktorá sa má oddeliť, zavádza do kolóny v prúde eluentu. Výstup zložiek zmesi z kolóny sa zaznamenáva na chromatograme ako píky. Z chromatogramu (obr.) určte:

retenčné časy neabsorbovateľných (t0), separovaných zložiek (tR1, tR2, tR3 atď.); šírka základne vrcholov (tw1, tw2 atď.).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif "width =" 61 "height =" 24 src = ">;

b) korigovaný objem držania komponentov ,

kde t "R - opravený retenčný čas komponentu;

c) pomer kapacity kolóny k danej zložke ;

d) účinnosť kolóny vyznačujúce sa tým počet ekvivalentných teoretických etáp

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif "width =" 129 "height =" 51 src = ">;

f) povolenie https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif "width =" 203 výška = 51 "height =" 51 ">

Kapacitný faktor k " má významný vplyv na hodnotu R S: na zmenu k"od 0 do 10 (optimálne limity) R S sa výrazne zvyšuje. Význam k " je určená zdvojeným povrchom sorbentu a jeho množstvom v kolóne, ako aj konštantou adsorpčnej rovnováhy (Henryho konštanta).

Koeficient selektivity α je určená rozdielom v adsorpčných rovnovážnych konštantách dvoch oddelených zložiek. So zvyšujúcim sa α (od 1 do ~ 5) R S sa prudko zvyšuje, s ďalším zvýšením α - sa mení len málo. Selektivita kolóny závisí od faktorov ako napr chemická štruktúra povrchy sorbentov, zloženie eluentu, teplota kolóny a štruktúra zlúčenín, ktoré sa majú separovať. Keďže sorpcia chromatografovaných látok v kvapalinovej chromatografii je určená párovou interakciou troch hlavných zložiek systému – sorbentu, látok, ktoré sa majú separovať, a eluentu, je zmena zloženia eluentu vhodným spôsobom optimalizácie separačný proces.

Účinnosť stĺpca závisí od veľkosti častíc a štruktúry pórov adsorbenta, od rovnomernosti náplne kolóny, viskozity eluentu a rýchlosti prenosu hmoty. Predĺženie kolóny nie vždy vedie k zlepšeniu separácie, pretože odpor kolóny sa zvyšuje, tlak eluentu na vstupe a čas experimentu sa zvyšujú a citlivosť a presnosť analýzy klesá v dôsledku rozšírenia píku analyzovanej zložky. . Ak, potom sú píky týchto dvoch látok na chromatograme takmer úplne oddelené. S rastom R S sa zvyšuje doba separácie. o R S < 1 - oddelenie je nevyhovujúce. Pri preparatívnej chromatografii v spojení so zavádzaním relatívne veľkého množstva separovaných látok sa kolóna prevádzkuje s preťažením. Tým sa znižuje kapacitný pomer, zvyšuje sa výška ekvivalentná teoretickej platni, čo vedie k zníženiu rozlíšenia.

4. Adsorbenty

Chromatografická separácia zmesi bude účinná, ak sa správne vyberie adsorbent a rozpúšťadlo (eluent).

Adsorbent by nemal chemicky interagovať s oddelenými zložkami, mal by vykazovať katalytický účinok na rozpúšťadlo. Je tiež potrebné, aby bol adsorbent selektívny vzhľadom na zložky zmesi. Správne zvolené vysúšadlo by malo mať maximálnu nasiakavosť.

Rozlišovať polárny (hydrofilný) a nepolárne (hydrofóbne) adsorbenty... Malo by sa pamätať na to, že adsorpčná afinita polárnych látok k polárnym sorbentom je oveľa vyššia ako afinita nepolárnych.

Ako adsorbenty sa používajú oxid hlinitý, aktívne uhlie, silikagél, zeolity, celulóza a niektoré minerály.

Oxid hlinitýAl2O3 – amfotérny adsorbent(obr.) zmesi je možné oddeliť látky v pol a v nepolárnych rozpúšťadlách... Neutrálny oxid hlinitý sa zvyčajne používa na chromatografiu z nevodných roztokov nasýtených uhľovodíkov, aldehydov, alkoholov, fenolov, ketónov a éterov.

Ryža. Oxid hlinitý pre chromatografiu

http: // obrázky. /542857_w200_h200_product5.jpg

Aktivita Al2O3 závisí od jeho vlhkosti. Najvyššiu aktivitu má bezvodý oxid hlinitý. Bežne sa berie ako jednotka. V prípade potreby môžete pripraviť oxid hlinitý s rôznym obsahom vlhkosti zmiešaním čerstvo pripraveného oxidu hlinitého s vodou (Brockmannova stupnica).

Závislosť aktivity oxidu hlinitého od obsahu vlhkosti

Napríklad na separáciu uhľovodíkov sa používa Al2O3 s aktivitou 1,5-2; na separáciu alkoholov a ketónov - 2-3,5.

Špecifický povrch oxidu hlinitého 230-380 m2 / g.

Silikagél(hydroxylovaný alebo chemicky modifikovaný) je sušený želatínový oxid kremičitý, ktorý sa získava z presýtených roztokov kyselín kremičitých ( n Si02 m H20) pri pH > 5-6. (obr.) Pevný hydrofilný sorbent.

Ryža. Silikagél

http://www. silikagél. /

http://silikagel. ru / obrázky / askg. gif

Veľkosť častíc silikagélu v analytických kolónach je 3-10 mikrónov, v preparatívnych kolónach - 20-70 mikrónov. Malá veľkosť častíc zvyšuje rýchlosť prenosu hmoty a zlepšuje účinnosť kolóny. Moderné analytické stĺpce sú dlhé 10-25 cm. Sú naplnené silikagélom s veľkosťou častíc 5 mikrónov a umožňujú separáciu zložitých zmesí 20-30 zložiek. Keď sa veľkosť častíc zmenšuje na 3-5 mikrónov, zvyšuje sa účinnosť kolóny, ale zvyšuje sa aj jej odpor. Takže na dosiahnutie prietoku eluentu 0,5-2,0 ml/min je potrebný tlak (1-3) · 107Pa. Silikagél vydrží takýto pokles tlaku, zatiaľ čo granule polymérneho sorbentu sú elastickejšie a deformovateľnejšie. Nedávno boli vyvinuté mechanicky pevné polymérne sorbenty s makroporéznou štruktúrou s hustou sieťou, ktoré sa svojou účinnosťou približujú silikagélom. Tvar častíc sorbentu s veľkosťou 10 μm a viac nemá veľký vplyv na účinnosť kolóny, uprednostňujú sa však guľovité sorbenty, ktoré poskytujú priepustnejšiu náplň.(obr.)

Ryža. Sférický silikagél

http: // obrázky. / 6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http: ///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

Vnútornou štruktúrou častice silikagélu je systém komunikačných kanálov. Na kvapalinovú chromatografiu sa používajú sorbenty s priemerom pórov 6-25 nm. Separácia kvapalinovou chromatografiou sa uskutočňuje najmä na silikagéloch modifikovaných reakciou alkyl a arylchlórsilánov alebo alkyletoxysilánov so silanolovými povrchovými skupinami. Pomocou takýchto reakcií sa navrúbľujú skupiny C8H17-, C18H37- alebo C6H5- (na získanie sorbentov s hydrofobizovaným povrchom), nitrilové, hydroxylové skupiny atď. (obr.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg "width =" 166 "height =" 116 src = ">

Ryža. Upravená štruktúra silikagélu

Silikagély používané v chromatografii na separáciu zmesí ropných produktov, vyš mastné kyseliny, ich estery, aromatické amíny, nitroderiváty Organické zlúčeniny. Silikagél – hydrofilný sorbent, ľahko zmáčateľné vodou. Preto sa nemôže použiť na sorpciu z vodných roztokov. Aktivita silikagélu závisí od obsahu vody: čím menej vody obsahuje, tým väčšia je aktivita (Brockmannova stupnica).

Závislosť aktivity silikagélu od obsahu vlhkosti

Špecifický povrch silikagélu je 500-600 m2 / g.

Aktívne uhlie sú formou uhlíka, ktorá sa počas spracovania stáva extrémne poréznou a získava veľmi veľký povrch pre adsorpciu alebo chemické reakcie.(obr.) Majú špecifický povrch 1300-1700 m2/g.

Ryža. Aktívne uhlie

http: // elektronický katalóg. rusbiznis. ru / user_images / ru / prod_picture / 58035161249b9016f64372.jpg

Hlavný vplyv na štruktúru pórov aktívneho uhlia majú východiskové suroviny na ich výrobu. Aktívne uhlie na báze kokosových škrupín sa vyznačujú väčším podielom mikropórov (do 2 nm), na báze uhlia - väčším podielom mezopórov (2-50 nm). Veľký podiel makropórov je charakteristický pre aktívne uhlie na báze dreva (viac ako 50 nm). Mikropóry sú obzvlášť vhodné na adsorpciu malých molekúl a mezopóry sú obzvlášť vhodné na adsorpciu väčších organických molekúl.

Zeolity (molekulárne sitá)- porézne kryštalické hlinitokremičitany alkalických kovov a kovov alkalických zemín prírodného a syntetického pôvodu. (ryža.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg "width =" 211 výška = 211 "height =" 211 ">

Ryža. zeolity

http://www. zeolit. spb. ru / _img / _36 mm. jpg

http: // kntgroup. ru / palec. php? súbor = / uploads / produkty / 6.jpg & x_width = 250

Existujú štyri typy zeolitov (A, X, Y, M) s rôznymi kryštálovými štruktúrami. V závislosti od katiónu sú zeolity označené nasledovne: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. Vlastnosti zeolitov je to? póry kryštálov majú veľkosť rádovo 0,4-1 nm, zodpovedajúcu veľkosti molekúl veľa kvapalných alebo plynných látok. Ak sú molekuly látky schopné preniknúť do týchto pórov, dochádza k adsorpcii v póroch kryštálov zeolitu. Väčšie molekuly látky nie sú adsorbované. Výberom zeolitov s rôznou veľkosťou pórov je možné jasne oddeliť zmesi rôznych látok.

Špecifický povrch zeolitov je 750-800 m2 / g.

Pri výbere adsorbenta je potrebné vziať do úvahy štruktúru látok a ich rozpustnosť. Napríklad nasýtené uhľovodíky sa adsorbujú zle, zatiaľ čo nenasýtené (majú dvojité väzby) sa adsorbujú lepšie. Funkčné skupiny zvyšujú adsorpčnú kapacitu látky.

5. Eluenty

Pri výbere rozpúšťadla (eluentu) je potrebné vziať do úvahy povahu adsorbenta a vlastnosti látok v zmesi, ktorá sa má oddeliť. Eluenty by mali dobre rozpúšťať všetky zložky chromatografovanej zmesi, mať nízku viskozitu, poskytovať požadovanú úroveň selektivity, byť lacné, netoxické, inertné a kompatibilné s detekčnými metódami (napríklad benzén nemožno použiť ako eluent s UV detektor).

Chromatografia na normálnej fáze zvyčajne používa uhľovodíky (hexán, heptán, izooktán, cyklohexán) s prídavkom malého množstva chloroformu CHCl3, izopropanol izo-C3H7OH, diizopropyléter; v chromatografii na reverznej fáze - zmes vody s acetonitrilom CH3CN, metanol CH3OH, etanol C2H5OH, dioxán, tetrahydrofurán, dimetylformamid. Aby sa izolovali jednotlivé zložky zmesi, oddelené počas chromatografie, často sa postupne vymývajú (eluujú). Na tento účel sa používajú rozpúšťadlá s rôznymi desorpčnými kapacitami. Rozpúšťadlá sú v polárnych adsorbentoch usporiadané v klesajúcom poradí podľa desorpčnej kapacity - eluotropná séria Trappe... Ak zložky zmesi, ktorá sa má oddeliť, majú blízke hodnoty k "( pomer kapacity kolóny vzhľadom na danú zložku), potom chromatografia s jedným eluentom. Ak sú jednotlivé zložky zmesi silne zadržané sorbentom, použije sa séria eluentov so zvyšujúcou sa silou.

Eluotropný rozsah rozpúšťadiel

6. Zariadenie na kvapalinovú chromatografiu

V modernej kvapalinovej chromatografii sa používajú zariadenia rôzneho stupňa zložitosti - od najjednoduchších systémov až po chromatografy vysokej triedy.
Moderný kvapalinový chromatograf zahŕňa: nádoby na eluenty, vysokotlakové čerpadlá, dávkovač, chromatografickú kolónu, detektor, záznamové zariadenie, riadiaci systém a matematické spracovanie výsledkov.

Na obr. predstavuje blokovú schému kvapalinového chromatografu obsahujúceho minimálnu požadovanú sadu komponentov, v tej či onej forme, prítomných v akomkoľvek chromatografickom systéme.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg "width =" 361 "height =" 254 src = ">

Ryža. Schéma kvapalinového chromatografu: 1- zásobník na mobilnú fázu, 2- čerpadlo, 3- injektor, 4- kolóna, 5- termostat, 6- detektory, 7- záznamový systém, 8- počítač.

Zásobník pre mobilnú fázu, musí mať dostatočnú kapacitu na analýzu a zariadenie na odplyňovanie rozpúšťadla aby sa vylúčila tvorba bublín plynov rozpustených v eluente v kolóne a detektore.

Pumpa zamýšľané aby sa vytvoril konštantný tok rozpúšťadla... Jeho dizajn je primárne určený prevádzkovým tlakom v systéme. Na prevádzku v rozsahu 10-500 MPa sa používajú čerpadlá typu piest (striekačky). Ich nevýhodou je nutnosť periodických prestávok pri plnení eluentom. Pre jednoduché systémy s nízkymi prevádzkovými tlakmi 1-5 MPa sa používajú lacné peristaltické čerpadlá. Eluenty vstupujú do čerpadla cez filter, ktorý zadržiava prachové častice (viac ako 0,2 mikrónu). Niekedy cez eluenty prechádza malý prúd hélia, aby sa odstránil rozpustený vzduch a zabránilo sa tvorbe bublín v detektore (najmä v prípade vodných a polárnych eluentov). V analytických chromatografoch sa na privádzanie eluentu do kolóny používajú piestové čerpadlá so spätnoväzbovým systémom, ktoré umožňujú vyhladenie pulzácie prietoku v rozmedzí 1-2% a poskytujú objemové rýchlosti od 0,1 do 25 ml/min pri zvýšenom tlaku. až ~ 3,107 Pa. Pri mikrokolónovej chromatografii sú objemové prietoky eluentu oveľa nižšie - 10-1000 μl / min. V prípade gradientovej elúcie sa používa niekoľko čerpadiel, ktoré sú riadené programátorom a dodávajú 2-3 zložky eluentu do zmiešavacej komory, pričom celkový prietok zostáva konštantný. Na vstreknutie vzorky do kolóny pod vysokým tlakom bez zastavenia prietoku použite špeciálne mikrodávkovacie kohútiky pripojené k slučke so známym objemom skúmaného roztoku. Boli vyvinuté dávkovacie systémy s automatickým odberom vzoriek a vstrekovaním vzoriek pomocou mikrodávkovacích ventilov alebo striekačiek.

Injektor poskytuje vstrekovanie vzorky zmesi zložky, ktoré sa majú rozdeliť do kolóny s dostatočne vysokou reprodukovateľnosťou. Jednoduché vzorkovacie systémy so stop-flow vyžadujú zastavenie čerpadla, a preto sú menej pohodlné ako slučkové pipety vyvinuté spoločnosťou Reodyne.

Reproduktory pre HPLC sa najčastejšie vyrábajú z leštenej nerezovej rúrky s dĺžkou 10-25 cm a vnútorným priemerom 3-5 mm.

Ryža. Chromatografické kolóny pre kvapalinovú chromatografiu

Tiež použiť sklenené stĺpy umiestnené v kovovom obale; v mikrostĺpcovej chromatografii - tlačené kovové stĺpy s vnútorným priemerom 1,0-1,5 mm, tlačené sklenené mikrokolóny s priemerom 70-150 mikrónov a duté kapilárne stĺpce s priemerom 10-100 mikrónov; v preparatívnej chromatografii - kolóny s priemerom 2 až 10 cm a viac. Na rovnomerné a husté plnenie kolón sorbentom sa používa metóda suspenzného balenia. Suspenzia sa pripravuje zo sorbentu a vhodnej organickej kvapaliny, ktorá sa privádza pod tlakom do 5 × 107 Pa do kolóny. Na určenie oddelených zložiek opúšťajúcich kolónu použitie detektory. Teplotná stálosť poskytnuté termostat.

Detektory pre kvapalinovú chromatografiu majú prietokovú kyvetu, v ktorej je kontinuálne meranie akejkoľvek vlastnosti prúdiaceho eluentu. Musia byť veľmi citlivé. Na zvýšenie citlivosti detektora sa niekedy používa derivatizácia zložiek zmesi za kolónou. Na tento účel sa s prúdom eluentu zavádzajú také činidlá, ktoré pri interakcii s oddelenými látkami tvoria deriváty s výraznejšími vlastnosťami, napríklad silnejšie absorbujú v UV alebo viditeľnej oblasti spektra alebo majú väčšiu fluorescenciu. schopnosť. Niekedy sa derivatizácia uskutočňuje pred chromatografickou analýzou a skôr sa oddeľujú deriváty ako východiskové materiály. Najobľúbenejšie typy detektory všeobecné účely sú refraktometre meranie index lomu a spektrofotometrické detektory definovanie optická hustota rozpúšťadla pri pevnej vlnovej dĺžke (zvyčajne v ultrafialovej oblasti). TO výhody refraktometrov(a nevýhody spektrofotometrov) treba pripísať nízka citlivosť na typ spojenia, ktoré môžu alebo nemusia obsahovať chromoforové skupiny. Na druhej strane je použitie refraktometrov obmedzené na izokratické systémy (s konštantným zložením eluentu), takže použitie gradientu rozpúšťadla je v tomto prípade nemožné.

Diferenciálny "href =" / text / kategória / diferenčný / "rel =" záložka "> diferenciálny zosilňovač a záznamník. integrátor, ktorý umožňuje vypočítať relatívne plochy výsledných píkov. Použitie komplexných chromatografických systémov jednotka rozhrania prepojenie chromatografu s osobný počítač, ktorá vykonáva nielen zber a spracovanie informácií, ale tiež riadi zariadenie, vypočítava kvantitatívne charakteristiky a v niektorých prípadoch aj kvalitatívne zloženie zmesí. Mikroprocesor poskytuje automatické vstrekovanie vzorky, zmeniť o daný program zloženia eluentu s gradientovou elúciou, udržiavanie teplota kolóny.

Bruker“. Ryža. Kvapalinový chromatograf Jasco

Samotestovacie otázky

Čo je kvapalinová chromatografia? Vymenujte jeho typy, oblasti použitia. Zoznam o Hlavné chromatografické veličiny a ich stanovenie Aké typy kvapalinovej chromatografie existujú v závislosti od mechanizmu retencie separovaných látok stacionárnou fázou LC? Aké typy chromatografie existujú v závislosti od spôsobu prepravy látky? Aké látky sa používajú ako adsorbenty? V čom je rozdiel? Čo slúži ako tekutá mobilná fáza – eluent? Požiadavky na rozpúšťadlá. Aký je rozdiel medzi deliacou chromatografiou a adsorpčnou chromatografiou? Uveďte hlavné časti okruhu kvapalinového chromatografu, ich účel.

Zoznam použitej literatúry

1 "Kvapalinová chromatografia v medicíne"

Http: // denník. issep. rssi. ru / články / pdf / 0011_035.pdf

2 „Úvod do metód vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie“

Http: // www. chemnet. ru / rus / vyučovanie / olej / spezprakt-chr. html

3 "Kvapalinová chromatografia"

Http: // e-science. ru / index /? id = 1540

4 "Chromatografia"

Http: // belchem. narod. ru / chromatografia1.html

"Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia prírodných a odpadových vôd znečisťujúcich látok"

Úvod

Kapitola 1. Základné pojmy a klasifikácia metód kvapalinovej chromatografie

1.1 Prístroj na kvapalinovú chromatografiu

Kapitola 2. Podstata HPLC

2.1 Aplikácia

Kapitola 3. Príklady použitia HPLC pri analýze objektov životného prostredia

Kapitola 4. Zariadenie pre HPLC

Literatúra

Aplikácia

Úvod

Chromatografické metódy sú často nevyhnutné na identifikáciu a kvantifikáciu organických látok s podobnou štruktúrou. Zároveň najpoužívanejšie na rutinné analýzy látok znečisťujúcich životné prostredie sú plynová chromatografia a vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Plynovochromatografická analýza organických polutantov v pitnej a odpadovej vode bola najskôr založená na použití náplňových kolón, neskôr sa rozšírili kremenné kapilárne kolóny. Vnútorný priemer kapilárnych kolón je zvyčajne 0,20-0,75 mm, dĺžka je 30-105 m. Optimálne výsledky pri analýze kontaminantov vo vode sa dosahujú najčastejšie pri použití kapilárnych kolón s rôznou hrúbkou filmu z metylfenylsilikónov s fenylovými skupinami 5 a 50%... Systém zavádzania vzorky sa často stáva zraniteľným miestom v chromatografických technikách využívajúcich kapilárne kolóny. Systémy zavádzania vzoriek možno rozdeliť do dvoch skupín: univerzálne a selektívne. Všestranné aplikácie zahŕňajú split a splitless vstrekovacie systémy, vstrekovanie do studenej kolóny a teplotne programované odparovanie. Pri selektívnom vstrekovaní sa používa fúkanie so stredným zachytávaním, analýza headspace atď. Pri použití univerzálnych vstrekovacích systémov sa do kolóny dostane celá vzorka, pri selektívnom vstrekovaní sa vstrekne len určitá časť. Výsledky získané selektívnym vstrekovaním sú oveľa presnejšie, pretože frakcia vstupujúca do kolóny obsahuje iba prchavé látky a technika môže byť v tomto prípade plne automatizovaná.

Plynové chromatografické detektory používané pri monitoringu škodlivín sa často delia na univerzálne detektory, ktoré reagujú na každú zložku v mobilnej fáze, a selektívne detektory, ktoré reagujú na prítomnosť určitej skupiny látok s podobnými chemickými vlastnosťami v mobilnej fáze. Medzi univerzálne patrí plameňová ionizácia, atómová emisia, hmotnostné spektrometrické detektory a infračervená spektrometria. Selektívne detektory používané pri analýze vody sú elektrónový záchyt (selektívny pre látky obsahujúce atómy halogénu), termoiónový (selektívny pre zlúčeniny obsahujúce dusík a fosfor), fotoionizačný (selektívny pre aromatické uhľovodíky), detektor elektrolytickej vodivosti (selektívny pre zlúčeniny, obsahujúci atómy halogénov síry a dusíka). Minimálne zistiteľné množstvá látok sú od nanogramov po pikogramy za sekundu.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia(HPLC) je ideálna metóda na stanovenie veľkého množstva tepelne labilných zlúčenín, ktoré nie je možné analyzovať plynovou chromatografiou. Moderné agrochemikálie, medzi ktoré patria metylkarbonáty a organofosfátové insekticídy a iné neprchavé látky, sa často stávajú predmetom analýzy kvapalinovou chromatografiou. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia si získava na popularite medzi inými metódami používanými pri monitorovaní životného prostredia, aj preto, že má dobré vyhliadky v oblasti automatizácie prípravy vzoriek.

KAPITOLA 1. ZÁKLADNÉ POJMY A KLASIFIKÁCIA METÓD KVAPALINOVEJ CHROMATOGRAFIE

Kvapalinová chromatografia je rozdelená do niekoľkých tried v závislosti od typu stacionárnej fázy. Jednoduchý hardvérový dizajn papierovej a tenkovrstvovej chromatografie viedol k širokému použitiu týchto metód v analytickej praxi. Veľké možnosti kvapalinovej stĺpcovej chromatografie však podnietili zlepšenie vybavenia pre túto klasickú metódu a viedli k rýchlemu zavedeniu HPLC. Prechod eluentu cez kolónu pod vysokým tlakom umožnil dramaticky zvýšiť rýchlosť analýzy a výrazne zvýšiť účinnosť separácie vďaka použitiu jemne dispergovaného sorbentu. Metóda HPLC v súčasnosti umožňuje izolovať, kvantitatívne a kvalitatívne analyzovať zložité zmesi organických zlúčenín.

Podľa mechanizmu interakcie separovanej látky (eluátu) so stacionárnou fázou sa rozlišuje adsorpčná, distribučná, iónomeničová, veľkostne vylučovacia, iónovo-párová, ligandovo-výmenná a afinitná chromatografia.

Adsorpčná chromatografia... Separácia adsorpčnou chromatografiou sa uskutočňuje ako výsledok interakcie separovanej látky s adsorbentom, ako je oxid hlinitý alebo silikagél, ktorý má na povrchu aktívne polárne centrá. Rozpúšťadlo (eluent) je nepolárna kvapalina. Sorpčný mechanizmus spočíva v špecifickej interakcii medzi polárnym povrchom sorbentu a polárnymi (resp. polarizovateľnými) oblasťami molekúl analyzovanej zložky (obr. 1).

Ryža. 1. Adsorpčná kvapalinová chromatografia.

Deliaca chromatografia... V distribučnom variante kvapalinovej chromatografie sa separácia zmesi látok uskutočňuje v dôsledku rozdielu v ich distribučných koeficientoch medzi dvoma nemiešateľnými fázami - eluentom (mobilná fáza) a fázou na sorbente (stacionárna fáza).

o normálna fáza Vo variante distribučnej kvapalinovej chromatografie sa používa nepolárny eluent a polárne skupiny naočkované na povrch sorbentu (najčastejšie silikagél). Ako modifikátory povrchu silikagélu (vrúbľované fázy) sa používajú substituované alkylchlórsilány obsahujúce polárne skupiny, ako je nitril, aminoskupiny atď. (obr. 2). Použitie očkovaných fáz umožňuje jemné riadenie sorpčných vlastností povrchu stacionárnej fázy a dosiahnutie vysokej účinnosti separácie.

Ryža. 2. Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (variant s normálnou fázou).

Obrátená fáza kvapalinová chromatografia je založená na rozdelení zložiek zmesi medzi polárny eluent a nepolárne skupiny (dlhé alkylové reťazce) navrúbľované na povrch sorbentu (obr. 3).

Ryža. 3. Deliaca chromatografia s naočkovanou fázou (verzia s obrátenými fázami).

Menej používaná verzia kvapalinovej chromatografie s nanesenými fázami je, keď sa kvapalná stacionárna fáza nanáša na stacionárny podklad.

Exkluzívne (prenikajúce do gélu) chromatografia je variant kvapalinovej chromatografie, pri ktorej dochádza k separácii látok v dôsledku distribúcie molekúl medzi rozpúšťadlom v póroch sorbentu a rozpúšťadlom prúdiacim medzi jeho časticami.

Afinný Chromatografia je založená na špecifických interakciách separovaných proteínov (protilátok) s látkami (antigénmi) navrúbľovanými na povrch sorbentu (syntetickej živice), pričom selektívne tvoria komplexy (konjugáty) s proteínmi.

Iónová výmenná chromatografia, iónovýmenná chromatografia a chromatografia na výmene ligandov sa používajú hlavne v anorganickej analýze.

Základné parametre chromatografickej separácie.

Hlavnými parametrami chromatografickej separácie sú retenčný objem a retenčný čas zložky zmesi (obr. 4).

Retenčný čas tR je čas, ktorý uplynie od momentu vstreknutia vzorky do kolóny, kým sa neobjaví maximum zodpovedajúceho píku. Vynásobením retenčného času objemovou rýchlosťou eluentu F získame retenčný objem VR:

Opravený retenčný čas - čas, ktorý uplynul od okamihu objavenia sa maxima píku nesorbovanej zložky po pík zodpovedajúcej zlúčeniny:

tR" = tR - t0 ;

Znížený alebo upravený retenčný objem je retenčný objem korigovaný na mŕtvy objem kolóny V0, t. j. retenčný objem nesorbovanej zložky:

VR = VR - V0;

Retenčnou charakteristikou je aj kapacitný koeficient k ", definovaný ako pomer hmotnosti látky v stacionárnej fáze k hmotnosti látky v mobilnej fáze: k" = mn / mp;

Hodnota k sa dá ľahko určiť z chromatogramu:

Najdôležitejšími parametrami chromatografickej separácie sú jej účinnosť a selektivita.

Účinnosť kolóny, meraná výškou teoretických poschodí (HETT) a nepriamo úmerná ich počtu (N), čím vyššia, tým užší je pík látky vystupujúcej v rovnakom retenčnom čase. Hodnotu účinnosti možno vypočítať z chromatogramu pomocou nasledujúceho vzorca:

N = 5,54. (tR / 1/2) 2,

kde tR- retenčný čas,

w 1/2 - šírka píku v polovici výšky

Pri znalosti počtu teoretických poschodí na kolónu, dĺžky kolóny L a priemerného priemeru zrna sorbentu dc je ľahké získať hodnoty výšky ekvivalentnej teoretickej úrovni (HETT) a zníženej výšky (PVETT):

VETT = L / N PVETT = VETT / d c

Tieto charakteristiky umožňujú porovnávať účinnosť rôznych typov kolón, hodnotiť kvalitu sorbentu a kvalitu plnenia kolón.

Selektivita separácie dvoch látok je určená rovnicou:

Pri uvažovaní o separácii zmesi dvoch zložiek je dôležitým parametrom aj stupeň separácie RS:

;

Píky sa považujú za povolené, ak je hodnota RS väčšia alebo rovná 1,5.

Hlavné chromatografické parametre sú spojené nasledujúcou rovnicou pre rozlíšenie:

;

Faktory určujúce selektivitu separácie sú:

1) chemická povaha sorbentu;

2) zloženie rozpúšťadla a jeho modifikátorov;

3) chemická štruktúra a vlastnosti zložiek zmesi, ktorá sa má oddeliť;

4) teplota kolóny

1.1 Prístroj na kvapalinovú chromatografiu

V modernej kvapalinovej chromatografii sa používajú zariadenia rôzneho stupňa zložitosti - od najjednoduchších systémov až po chromatografy vysokej triedy vybavené rôznymi prídavnými zariadeniami.

Na obr. 4. je bloková schéma kvapalinového chromatografu obsahujúceho minimálnu požadovanú sadu komponentov, v tej či onej forme, prítomných v akomkoľvek chromatografickom systéme.

Ryža. 4. Bloková schéma kvapalinového chromatografu.

Čerpadlo (2) je navrhnuté tak, aby vytváralo konštantný prietok rozpúšťadla. Jeho dizajn je primárne určený prevádzkovým tlakom v systéme. Na prevádzku v rozsahu 10-500 MPa sa používajú piestové (striekačky) alebo piestové čerpadlá. Nevýhodou prvého je potreba pravidelných prestávok na plnenie eluentom a druhého veľká zložitosť konštrukcie a v dôsledku toho vysoká cena. Pre jednoduché systémy s nízkymi prevádzkovými tlakmi 1-5 MPa sa úspešne používajú lacné peristaltické čerpadlá, ale keďže je ťažké dosiahnuť konštantný tlak a prietok, ich použitie je obmedzené na prípravné úlohy.

Injektor (3) zaisťuje, že vzorka zmesi zložiek, ktoré sa majú separovať, je vstrekovaná do kolóny s dostatočne vysokou reprodukovateľnosťou. Jednoduché vzorkovacie systémy so stop-flow vyžadujú zastavenie čerpadla, a preto sú menej pohodlné ako slučkové pipety vyvinuté spoločnosťou Reodyne.

HPLC kolóny (4) sú hrubostenné rúrky z nehrdzavejúcej ocele, ktoré vydržia vysoký tlak. Dôležitú úlohu zohráva hustota a rovnomernosť náplne kolóny so sorbentom. Pre kvapalinovú chromatografiu nízky tlak s úspechom sa používajú hrubostenné sklenené stĺpy. Teplotnú stálosť zabezpečuje termostat (5).

Detektory (6) pre kvapalinovú chromatografiu majú prietokovú kyvetu, v ktorej sa kontinuálne merajú niektoré vlastnosti prúdiaceho eluentu. Najpopulárnejšími typmi detektorov na všeobecné použitie sú refraktometre, ktoré merajú index lomu, a spektrofotometrické detektory, ktoré merajú absorbanciu rozpúšťadla pri pevnej vlnovej dĺžke (zvyčajne v ultrafialovej oblasti). Medzi výhody refraktometrov (a nevýhody spektrofotometrov) patrí nízka citlivosť na typ stanovovanej zlúčeniny, ktorá nemusí obsahovať chromoforové skupiny. Na druhej strane je použitie refraktometrov obmedzené na izokratické systémy (s konštantným zložením eluentu), takže použitie gradientu rozpúšťadla je v tomto prípade nemožné.

HPLC kolóny, ktoré sa najčastejšie používajú pri analýze látok znečisťujúcich životné prostredie, majú dĺžku 25 cm a vnútorný priemer 4,6 mm, sú naplnené guľovitými časticami silikagélu s veľkosťou 5-10 μm naočkovanými oktadecylovými skupinami. V posledných rokoch sa objavili kolóny s menšími vnútornými priemermi, plnené menšími časticami. Použitie takýchto kolón vedie k zníženiu spotreby rozpúšťadla a času analýzy, zvýšeniu citlivosti a účinnosti separácie a tiež uľahčuje problém pripojenia kolón k spektrálnym detektorom. Kolóny s vnútorným priemerom 3,1 mm sú vybavené bezpečnostnou patrónou (predkolónou) pre zvýšenie životnosti a zlepšenie reprodukovateľnosti analýz.

Ako detektory v moderných HPLC prístrojoch sa zvyčajne používa UV detektor na diódovej matrici, fluorescenčný a elektrochemický.

Treba mať na pamäti, že v praktickej práci separácia často prebieha nie jeden po druhom, ale prostredníctvom niekoľkých mechanizmov súčasne. Vylučovacia separácia je teda komplikovaná adsorpčnými efektmi, adsorpčnou - distribúciou a naopak. V tomto prípade platí, že čím väčší je rozdiel medzi látkami vo vzorke z hľadiska stupňa ionizácie, zásaditosti alebo kyslosti, molekulovej hmotnosti, polarizovateľnosti a iných parametrov, tým väčšia je pravdepodobnosť rozdielneho separačného mechanizmu pre takéto látky.

V praxi je najrozšírenejšia „reverzná fáza“ (distribučná) chromatografia, pri ktorej nie je stacionárna fáza polárna, ale mobilná fáza je polárna (tj reverzná chromatografia s „priamou fázou“).

Vo väčšine laboratórií na svete sa skupina 16 prioritných PAH analyzuje pomocou HPLC alebo CMS.

KAPITOLA 2. PODSTATA HPLC

Pri vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii (HPLC) je povaha procesov prebiehajúcich v chromatografickej kolóne vo všeobecnosti identická s procesmi v plynovej chromatografii. Jediným rozdielom je použitie kvapaliny ako stacionárnej fázy. Vzhľadom na vysokú hustotu kvapalných mobilných fáz a vysoký odpor kolóny sa plynová a kvapalinová chromatografia značne líšia svojim hardvérovým dizajnom.

V HPLC sa ako mobilné fázy zvyčajne používajú čisté rozpúšťadlá alebo ich zmesi.

Na vytvorenie prúdu čistého rozpúšťadla (alebo zmesí rozpúšťadiel), ktorý sa v kvapalinovej chromatografii nazýva eluent, sa v hydraulickom systéme chromatografu používajú čerpadlá.

Adsorpčná chromatografia sa uskutočňuje ako výsledok interakcie látky s adsorbentmi, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, ktoré majú aktívne centrá na povrchu. Rozdiel v schopnosti interagovať s adsorpčnými centrami rôznych molekúl vzorky vedie k ich rozdeleniu do zón počas pohybu s mobilnou fázou pozdĺž kolóny. Oddelenie zón zložiek dosiahnuté v tomto prípade závisí od interakcie s rozpúšťadlom a adsorbentom.

Silikagélové adsorbenty s rôznymi objemami, povrchmi a priemermi pórov sa najčastejšie používajú v HPLC. Oxid hlinitý a iné adsorbenty sa používajú oveľa menej často. Hlavným dôvodom je:

Nedostatočná mechanická pevnosť, ktorá bráni zabaleniu a použitiu vysoké tlaky typické pre HPLC;

silikagél má v porovnaní s oxidom hlinitým širší rozsah pórovitosti, povrchu a priemeru pórov; výrazne vyššia katalytická aktivita oxidu hlinitého vedie k skresleniu výsledkov analýzy v dôsledku rozkladu zložiek vzorky alebo ich nevratnej chemisorpcie.

HPLC detektory

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa používa na detekciu polárnych neprchavých látok, ktoré sa z akéhokoľvek dôvodu nedajú previesť do formy vhodnej pre plynovú chromatografiu, a to ani vo forme derivátov. Medzi takéto látky patria najmä sulfónové kyseliny, vo vode rozpustné farbivá a niektoré pesticídy, ako sú deriváty fenylmočoviny.

Detektory:

UV - diódový detektor poľa. „Matrica“ fotodiód (je ich viac ako dvesto) neustále registruje signály v UV a viditeľnej spektrálnej oblasti, čím zabezpečuje záznam UV-B spektier v režime skenovania. To umožňuje nepretržite zaznamenávať s vysokou citlivosťou neskreslené spektrá komponentov rýchlo prechádzajúcich špeciálnou bunkou.

V porovnaní s detekciou jednej vlnovej dĺžky, ktorá neposkytuje informácie o „čistote“ píku, možnosť porovnať celé spektrá diódového poľa poskytuje výsledok identifikácie s oveľa väčšou mierou spoľahlivosti.

Fluorescenčný detektor. Veľká obľuba fluorescenčných detektorov je spôsobená veľmi vysokou selektivitou a citlivosťou a tým, že mnohé látky znečisťujúce životné prostredie fluoreskujú (napríklad polyaromatické uhľovodíky).

Elektrochemický detektor sa používa na detekciu látok, ktoré sa ľahko oxidujú alebo redukujú: fenoly, merkaptány, amíny, aromatické nitro a halogénderiváty, ketónaldehydy, benzidíny.

Chromatografická separácia zmesi na kolóne v dôsledku pomalého postupu PP trvá dlho. Na urýchlenie procesu sa chromatografia uskutočňuje pod tlakom. Táto metóda sa nazýva vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

Modernizácia zariadenia používaného v klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografii z nej urobila jednu z najsľubnejších a najmodernejších metód analýzy. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia je vhodná metóda na separáciu, preparatívnu izoláciu a kvalitatívnu a kvantitatívnu analýzu neprchavých termolabilných zlúčenín s nízkou aj vysokou molekulovou hmotnosťou.

V závislosti od typu použitého sorbentu táto metóda využíva 2 možnosti chromatografie: na polárnom sorbente s použitím nepolárneho eluentu (možnosť priamej fázy) a na nepolárnom sorbente s použitím polárneho eluentu - tzv. -výkonná kvapalinová chromatografia (HPLC).

Keď eluent prechádza do eluentu, rovnováha v podmienkach HPLC sa ustanoví mnohonásobne rýchlejšie ako v podmienkach polárnych sorbentov a nevodných PP. V dôsledku toho, ako aj pohodlnosti práce s vodnými a vodno-alkoholickými elučnými činidlami, si Off-HPLC v súčasnosti získala veľkú popularitu. Väčšina analýz HPLC sa uskutočňuje pomocou tejto metódy.

Detektory. Registrácia výstupu z kolóny samostatného komponentu sa vykonáva pomocou detektora. Na registráciu môžete použiť zmenu akéhokoľvek analytického signálu prichádzajúceho z mobilnej fázy a súvisiaceho s povahou a množstvom zložky zmesi. V kvapalinovej chromatografii sa využívajú analytické signály ako absorpcia svetla alebo emisia svetla výstupného roztoku (fotometrické a fluorometrické detektory), index lomu (refraktometrické detektory), potenciál a elektrická vodivosť (elektrochemické detektory) atď.

Priebežne detekovaný signál je zaznamenaný záznamníkom. Chromatogram je sekvencia signálov detektora zaznamenaná na záznamovej páske, generovaná, keď jednotlivé zložky zmesi opúšťajú kolónu. V prípade separácie zmesi sú na vonkajšom chromatograme viditeľné jednotlivé píky. Poloha píku na chromatograme sa používa na účely identifikácie, výška alebo plocha píku sa používa na účely kvantifikácie.

2.1 Aplikácia

HPLC sa najčastejšie používa v nasledujúcich oblastiach chemickej analýzy (predmety analýzy sú zvýraznené, kde HPLC prakticky nemá konkurenciu):

Kontrola kvality potravín - tonizujúce a dochucovacie prísady, aldehydy, ketóny, vitamíny, cukry, farbivá, konzervačné látky, hormonálne lieky, antibiotiká, triazín, karbamát a iné pesticídy, mykotoxíny, nitrozamíny, polycyklické aromatické uhľovodíky atď.

· Ochrana životného prostredia - fenoly, organické nitrozlúčeniny, mono- a polycyklické aromatické uhľovodíky, množstvo pesticídov, hlavné anióny a katióny.

· Forenzná veda – drogy, organické výbušniny a farbivá, silné liečivá.

· Farmaceutický priemysel - steroidné hormóny, prakticky všetky produkty organickej syntézy, antibiotiká, polymérne prípravky, vitamíny, proteínové prípravky.

Medicína - uvedená biochemická a liečivé látky a ich metabolitov v biologických tekutinách (aminokyseliny, puríny a pyrimidíny, steroidné hormóny, lipidy) pri diagnostike chorôb, určovaní rýchlosti vylučovania liečiv z organizmu za účelom ich individuálneho dávkovania.

· poľnohospodárstvo- stanovenie dusičnanov a fosforečnanov v pôdach na stanovenie potrebného množstva aplikovaných hnojív, stanovenie nutričnej hodnoty krmív (aminokyseliny a vitamíny), rozbor pesticídov v pôde, vode a poľnohospodárskych produktoch.

Biochémia, bioorganická chémia, genetické inžinierstvo, biotechnológia - cukry, lipidy, steroidy, proteíny, aminokyseliny, nukleozidy a ich deriváty, vitamíny, peptidy, oligonukleotidy, porfyríny atď.

· Organická chémia - všetky stabilné produkty organickej syntézy, farbivá, termolabilné zlúčeniny, neprchavé zlúčeniny; anorganická chémia(takmer všetky rozpustné zlúčeniny vo forme iónov a komplexných zlúčenín).

· Kontrola kvality a bezpečnosti potravinárskych výrobkov, alkoholických a nealkoholických nápojov, pitnej vody, chemikálií pre domácnosť, parfumov vo všetkých fázach ich výroby;

· Určenie povahy znečistenia na mieste katastrofy spôsobenej ľudskou činnosťou alebo mimoriadnej udalosti;

· Detekcia a analýza omamných, silných, jedovatých a výbušných látok;

· Stanovenie prítomnosti škodlivých látok (polycyklické a iné aromatické uhľovodíky, fenoly, pesticídy, organické farbivá, ióny ťažkých, alkalických kovov a kovov alkalických zemín) v kvapalných odpadoch, emisiách do ovzdušia a tuhých odpadoch podnikov a v živých organizmoch;

· Monitorovanie procesov organickej syntézy, rafinácie ropy a uhlia, biochemického a mikrobiologického priemyslu;

analýza kvality pôdy na hnojenie, prítomnosť pesticídov a herbicídov v pôde, vode a produktoch, ako aj nutričná hodnota krmív; komplexné výskumné analytické úlohy; získanie stopového množstva ultračistej látky.

KAPITOLA 3. PRÍKLADY POUŽITIA HPLC PRI ANALÝZE ENVIRONMENTÁLNYCH OBJEKTOV

HPLC - metóda na monitorovanie PAU v objektoch životného prostredia

Pre polycyklické aromatické uhľovodíky (PAH), ekotoxické látky 1. triedy nebezpečnosti, boli stanovené extrémne nízke hladiny maximálnych povolených koncentrácií (MPC) v prírodných objektoch. Stanovenie PAH na úrovni MPC a nižšej je jednou z veľmi zložitých analytických úloh a na ich riešenie sa využívajú high-tech metódy analýzy (GC-MS, GC, HPLC). Pri výbere metódy monitorovania sa k hlavným uvažovaným charakteristikám - citlivosti a selektivite, rýchlosti a účinnosti pridávajú od r monitorovanie zahŕňa sériovú analýzu. Možnosť HPLC na krátkych kolónach s malým priemerom tieto požiadavky do značnej miery spĺňa. Pomocou tejto metódy autori vyvinuli a certifikovali metódy na monitorovanie benzo[a]pyrénu v troch prírodných prostrediach: aerosól, snehová pokrývka a povrchové vody. Techniky sa vyznačujú: jednoduchou unifikovanou prípravou vzorky vrátane extrakcie PAU organickými rozpúšťadlami a zahustením extraktu, priamym zavedením koncentrovaného extraktu do chromatografickej kolóny, využitím viacvlnovej fotometrickej detekcie v UV oblasti spektrum, identifikácia píkov PAH v chromatogramoch pomocou dvoch parametrov, retenčného času a spektrálneho pomeru ... Celková chyba nepresahuje 10 % pri stanovení benzo [a] pyrénu v aerosóle v koncentračnom rozsahu od 0,3 do 450 ng / m 3, v povrchových vodách v koncentračnom rozsahu od 10 do 1 000 ng / l, v snehovej pokrývke v r. rozsah povrchovej hustoty od 0,5 do 50 μg/m2. V prípade súčasného stanovenia prioritných PAH (do 12 zlúčenín) a registrácie nehomogénnych píkov analytov je potrebné opakovanú separáciu extraktu so zmenou selektivity mobilnej fázy, detekčnej vlnovej dĺžky a teploty kolóny s prihliadnutím na jednotlivých vlastností stanovených PAU.

1 ... Kvalita okolitého vzduchu. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. HPLC meracia technika. Osvedčenie o atestácii MVI č. 01-2000.

2 ... Kvalita povrchových a čistených odpadových vôd. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. HPLC meracia technika. Osvedčenie o atestácii MVI č. 01-2001.

3 ... Kvalita snehu. Hmotnostná koncentrácia benzo[a]pyrénu. HPLC meracia technika. Osvedčenie o atestácii MVI č. 02-2001.

Odstránenie anilínu z vodných roztokov pomocou odpadovej aluminotermickej redukcie valcovaných medených okují

Problém odstraňovania uhľovodíkov z odpadových vôd je naliehavým problémom. V mnohých chemických, petrochemických a iných priemyselných odvetviach vzniká anilín a jeho deriváty, čo sú toxické látky. Anilín je vysoko toxická látka, maximálna koncentrácia je 0,1 mg/m3. Anilín a jeho deriváty sú rozpustné vo vode, a preto ich nemožno odstrániť gravitačným usadzovaním.

Jednou z najlepších metód na čistenie odpadových vôd od organických polutantov je použitie anorganických a organických adsorbentov schopných regenerácie (hlinitosilikáty, modifikované íly, drevo, vlákna atď.) a neschopných regenerácie (aktívne uhlie, makroporézne polymérne materiály atď.) .).

Regenerované adsorbenty dokážu z vody odstrániť organické látky rôznej polarity. Hľadanie účinných adsorbentov je naliehavou úlohou.

Táto správa prezentuje výsledky výskumu v oblasti aplikácie valcovaných medených okují Jerevanského závodu na výrobu káblov (OPMOERKZ) ako anilínových sorbentov.

Chromatografické štúdie sa uskutočnili na HPLC chromatografe / vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografii / systémoch (Waters 486 - detektor, Waters 600S - kontrolér, Waters 626 - Pump), na kolóne 250 x 4 mm naplnenej skúmanými sorbentmi, mobilnou fázou rýchlosť 1 ml / m / mobilná fáza sú nami skúmané rozpúšťadlá /, detektor je UV-254. UV spektroskopická analýza sa uskutočnila na spektrofotometri Specord-50, spektrá sa získali pomocou počítačového programu ASPECT PLUS.

K určitým objemom anilínu vo vode sa pridávali presne navážené dávky sorbentov, ktorých počiatočné koncentrácie sa menili. Zmes sa dôkladne pretrepáva 6 hodín a potom sa vzorka nechá usadiť. Adsorpcia je ukončená prakticky do 48 hodín Množstvo vyzrážaného anilínu bolo stanovené UV spektrofotometrickou a refraktometrickou analýzou.

Najprv sa skúmali adsorpčné vlastnosti OPMOErKZ, keď sa anilín odstránil z roztoku v tetrachlórmetáne. Ukázalo sa, že anilín najlepšie absorbuje sorbent 3 (tabuľka).

Merania boli vykonané aj pre vodné roztoky anilínu v koncentráciách 0,01-0,0001 mol/l. V tabuľke sú uvedené údaje pre 0,01 M roztok.

Absorpcia anilínu rôznymi sorbentmi z 0,01 M vodného roztoku anilínu pri 20 °C

Už skôr sa zistilo, že adsorpcia sa zvyšuje v rámci špecifikovaného koncentračného rozsahu a lineárne závisí od indexu lomu. Množstvo anilínu sa určilo z grafického vzťahu "index lomu - molárna koncentrácia" a korigovalo sa údajmi kvapalinovej chromatografie a UV spektrálnej analýzy.

Pre vodné roztoky je najaktívnejší sorbent 3. Množstvo adsorbovanej škodliviny bolo vypočítané ako rozdiel medzi celkovým množstvom znečisťujúcej látky pridanej do pôvodného roztoku a jej zvyškom v konečnom roztoku.

Metódy stanovenia PAU v objektoch životného prostredia

Na stanovenie PAH sa zvyčajne používajú metódy plynovej chromatografie (GC) a vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). separácia hlavných 16 PAH, postačujúca na kvantitatívnu analýzu, sa dosiahne použitím buď kapilárnych kolón v plynovej chromatografii, alebo vysokovýkonných kolón používaných v HPLC. Malo by sa pamätať na to, že kolóna, ktorá dobre separuje kalibračné zmesi šestnástich PAH, nezaručuje, že sa budú dobre separovať aj na pozadí sprievodných organických zlúčenín v testovaných vzorkách.

V záujme zjednodušenia analýzy, ako aj dosiahnutia vysokej kvality získaných výsledkov väčšina analytických postupov obsahuje fázu predbežnej izolácie (separácie) PAU od ostatných skupín príbuzných zlúčenín vo vzorkách. Najbežnejšie používané metódy na tento účel sú kvapalinová-tuhá látka alebo kvapalina-kvapalina nízkotlaková kvapalinová chromatografia využívajúca adsorpčné mechanizmy, ako je silikagél alebo oxid hlinitý, niekedy zmiešané mechanizmy, ako je adsorpcia a eliminácia pomocou Sephadexu.

Použitie predbežného čistenia vzoriek umožňuje vyhnúť sa vplyvu:

Úplne nepolárne zlúčeniny, ako sú alifatické uhľovodíky;

Stredne až vysoko polárne zlúčeniny, ako sú ftalány, fenoly, viacsýtne alkoholy, kyseliny;

Vysokomolekulárne zlúčeniny, ako sú napríklad živice.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) využíva najmä dva typy detektorov: fluorometrický detektor alebo spektrofotometrický detektor s fotodiódovým poľom. Detekčný limit pre PAH pri fluorometrickej detekcii je veľmi nízky, čo robí túto metódu obzvlášť vhodnou na stanovenie stopových množstiev polyaromatických zlúčenín. Klasické fluorometrické detektory však neposkytujú prakticky žiadne informácie o štruktúre skúmanej zlúčeniny. Moderné konštrukcie umožňujú zaznamenať fluorescenčné spektrá, ktoré sú charakteristické pre jednotlivé zlúčeniny, no v praxi rutinných meraní sa zatiaľ nerozšírili. Spektrofotometrický detektor s fotodiódovým pravítkom (PDL) umožňuje zaznamenávať absorpčné spektrá v UV a viditeľnom spektrálnom rozsahu, tieto spektrá je možné použiť na identifikáciu. Podobné informácie možno získať pomocou detektorov rýchleho skenovania.

Pri výbere analytickej techniky na separáciu, identifikáciu a kvantitatívnu analýzu uvedených PAH je potrebné vziať do úvahy nasledujúce podmienky:

hladina stanovených obsahov v skúšobných vzorkách;

Počet príbuzných látok;

Použitý analytický postup (technika merania);

Schopnosti sériového zariadenia.

Vývoj metódy na stanovenie prvkov alkalických zemín a horčíka iónovou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou

Vývoj a zdokonaľovanie metód, ktoré umožňujú riešiť problémy analýzy vody, je dôležitým problémom analytickej chémie. Rozvoj vysokoúčinnej vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie podnietil vývoj nového smeru v iónovo-výmennej chromatografii, takzvanej iónovej chromatografii. Syntéza sorbentov pre iónovú chromatografiu je náročná, pretože je na ne kladených veľa požiadaviek. Pre nedostatok komerčne dostupných vysoko účinných katexov bola použitá dynamicky modifikovaná reverzná fáza, pre ktorú bol syntetizovaný modifikátor: kyselina N-hexadecyl-N-dekanoyl-paraminobenoylsulfónová etyl-diizopropylamónium (DHDASK), kde hydrofóbny amín obsahujúci SO 3 - skupina, schopná výmeny katiónov. Po prechode roztokom modifikátora dosiahla absorpcia pri l = 260 nm 6,4 jednotiek optickej hustoty (°E) s plató. Vypočítaná kapacita výmeny iónov je 15,65 μmol. Keďže katióny prvkov alkalických zemín a horčíka neabsorbujú v UV oblasti spektra, bola použitá nepriama UV detekcia s použitím syntetizovaného UV absorbujúceho eluentu 1,4-dipyridíniumbutánbromidu (DPB bromid). Pretože halogénové ióny ničia oceľové časti kolóny, bol bromidový ión 1,4-dipyridíniumbutánu nahradený acetátovým iónom. Keď sa kolóna premyje eluentom, protiión modifikátora, etyldiizopropylamónium, sa nahradí UV-absorbujúcim 1,4-dipyridíniumbutánovým iónom. Separácia katiónov bola uskutočnená pri optimálnej vlnovej dĺžke l = 260 nm na stupnici 0,4 A v režime „skladanie mierky“; polarita rekordéra bola obrátená. Separácia všetkých študovaných katiónov bola dosiahnutá zavedením komplexotvornej prísady, kyseliny šťaveľovej. Detekčné limity pre Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ sú 8 μg / l; 16 ug/l; 34 ug/l; 72 μg/l, resp. Za zvolených podmienok bola analyzovaná voda z vodovodu, v ktorej je obsah Ca 2+ 10,6 + 1,9 mg iónu / l, Mg 2 + -2,5 + mg iónu / l. Chyba reprodukovateľnosti nepresahuje -2,2 % pre Ca2+ a 1,4 % pre Mg2+.

Analýza komplexov kadmia v životnom prostredí

Na štúdium mechanizmov migrácie ťažkých kovov v biosfére sú potrebné údaje o chemických formách existencie kovov v prírode. Ťažkosti pri analýze zlúčenín jedného z najtoxickejších kovov – kadmia – sú spojené s tým, že vytvára krehké komplexy a pri pokuse o ich izoláciu dochádza k narušeniu prirodzenej rovnováhy. V tejto práci boli študované zlúčeniny kadmia v pôde a rastlinách pomocou techniky založenej na chromatografickej separácii extraktov s následnou identifikáciou zložiek chemickou analýzou. Tento prístup umožnil nielen identifikovať chemické formy kadmia, ale aj sledovať ich premeny v objektoch životného prostredia.

OH-skupiny sacharidov a polyfenolov (vrátane flavonoidov), C = O, fosfáty, NH 2, NO 2, SH-skupiny sú koordinované s kadmiom v objektoch biosféry. Na účely tejto štúdie bol zostavený súbor modelových ligandov reprezentujúcich tieto triedy zlúčenín. Interakcia modelových ligandov s vo vode rozpustnými soľami kadmia bola študovaná UV spektroskopiou a HPLC.

Na izoláciu zlúčenín kadmia sme použili extrakciu špeciálne vybranými (netvoriacimi komplexy s Cd) rozpúšťadlami. Týmto spôsobom je možné oddeliť kadmium od všetkých ťažkých kovov, okrem jeho blízkeho chemického analógu - zinku. Píky obsahujúce kadmium a zinok v chromatogramoch získaných extraktov boli detekované väzbou kovov vo forme ich ditizonátov. Na separáciu od zinku bol použitý rozdiel v stabilite komplexov Cd a Zn pri pH 6-8. Izolované Cd zlúčeniny boli identifikované pomocou HPLC so zmenou pH počas elúcie. Uskutočnila sa analýza zlúčenín kadmia so zložkami pôd a rastlinných tkanív a identifikovali sa látky produkované rastlinami v reakcii na zvýšený príjem kadmia z pôdy. Ukázalo sa, že flavonoidy, najmä tricín, sú ochrannými látkami v obilninách, alkoxyderiváty cysteínu v strukovinách a polyfenoly aj tioly v krížoch.

KAPITOLA 4. VYBAVENIE HPLC

SÉRIA ACCELA

Nový ultra-výkonný kvapalinový chromatograf ACCELA je schopný pracovať v najširšom rozsahu prietokov a tlakov, pričom poskytuje typickú HPLC separáciu na konvenčných kolónach a ultrarýchlu a efektívnu separáciu na kolónach s veľkosťou častíc sorbentu menšou ako 2 μm pri ultravysokých tlakoch (nad 1000 atm.).

Systém obsahuje vstupné čerpadlo so štvrťročným gradientom, schopné dosahovať tlaky presahujúce 1000 barov a so zásobným objemom iba 65 μl, na vysokorýchlostnú chromatografickú separáciu. Autosampler ACCELA je schopný pracovať v 30 sekundovom cykle vstrekovania vzorky a poskytuje najvyššiu reprodukovateľnosť vstrekovania. Detektor diódového poľa Accela PDA s minimalizovaným objemom prietokovej kyvety (2 μL) je optimalizovaný pre režim vysokorýchlostnej chromatografie, využíva patentovanú technológiu LightPipe a zachováva si symetrický tvar piku, ktorý je zabezpečený použitím bezchybného chromatografického systému a kolón.

Systém sa dokonale integruje s hmotnostnými spektrometrami a vytvára najvýkonnejšie a najlepšie systémy HPLC / MS dostupné na svete.

UHP kolóny s veľkosťou zrna 1,9 μm dostupné od Thermo Electron pre akúkoľvek aplikáciu

SÉRIA TSP

Modulárny princíp konštrukcie HPLC prístrojov umožňuje zákazníkovi flexibilne dopĺňať vybavenie na riešenie akýchkoľvek analytických úloh a pri ich zmene je možné ho rýchlo a ekonomicky upraviť. Široká škála modulov zahŕňa čerpadlá od izokratických až po štvorzložkové gradienty, od mikrokolón až po semipreparatívne, všetky dostupné detektory, systémy vstrekovania vzoriek od ručných injektorov po autosamplery so schopnosťou manipulovať so vzorkami akéhokoľvek druhu, výkonný softvér na spracovanie merania výsledky a ovládanie všetkých modulov systému. Všetky moduly sú certifikované podľa CSA, TUF/GS, FCC (EMI), VDE (EMI), ISO-9000, sú kompaktné, majú moderný dizajn, ľahko sa ovládajú, sú vybavené vstavaným displejom a samost. -diagnostický systém, umožňuje vytvárať a ukladať parametre metód úloh. Spĺňajú kritériá „Správnej laboratórnej praxe“ (SLP) a sú uvedené v Registri meracích prístrojov Ruskej federácie. Správy o meraní sa vydávajú v súlade s liekopismi Anglicka, USA, Nemecka a Francúzska.

Modulárne systémy TSP sa vyznačujú najvyššou spoľahlivosťou a prevádzkovou stabilitou.

Kombinácia modulov poskytuje analytikovi všetky výhody integrovaného systému na jednej strane a flexibilitu modulárneho systému na strane druhej. V akejkoľvek oblasti použitia vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) - farmakológia, biotechnológia, environmentálna analýza, klinická analýza, analýza produkty na jedenie a nápojov, analýza petrochemických a chemických produktov - toto zariadenie nebolo používané, vždy je optimálne nakonfigurované tak, aby spĺňalo najvyššie požiadavky.

Výskumné aj vysokovýkonné rutinné systémy poskytujú:

Vysoko účinné odplynenie rozpúšťadla

Schopnosť manipulovať s malými a veľmi malými množstvami vzoriek

Najvyššia citlivosť, s UV/VIS detektorom aj diódovým poľom (so známou technológiou LightPipe s dĺžkou optickej dráhy 1 alebo 5 cm voliteľne)

Práca s rôznymi stĺpcami

Najvyššia presnosť kvantifikácie

Možnosť automatickej práce s rôznymi objemami vzoriek

Chyba retenčného času rms menšia ako 0,3 %

Minimálna stopa systému

Najvyššia spoľahlivosť a stabilita parametrov.

Surveyor LC Pump- HPLC pumpa s najlepšou reprodukovateľnosťou retenčného času zo všetkých štvorcestných gradientových púmp dostupných na svete. Integrovaný štvorkanálový vákuový odplyňovač a tlmič pulzácií poskytuje vynikajúcu základnú stabilitu pre maximálnu citlivosť a presnosť kvantifikácie.

Autosampler poskytuje najvyšší analytický výkon a flexibilitu. Široký výber podnosov na vzorky – od štandardných fľaštičiek po 96 – a 384-jamkové mikrodoštičky – pokrýva potreby prakticky všetkých aplikácií. Nová technológia poskytuje prakticky bezstratové vstrekovanie vzorky, takmer 5 μl vzorky sa vstrekne pomocou autosamplera z celkového objemu vzorky 5 μL.

SURVEYOR

UV/Vis detektor a PDA (Diode Array Detector)

Surveyor UV / Vis- detektor UV / viditeľného svetla s premenlivou vlnovou dĺžkou je kombináciou hospodárnosti a spoľahlivosti s najvyššou citlivosťou technológie LightPipe. Široký výber prietokových komôr robí tento detektor všestranným pre všetky aplikácie od kapilárnej alebo mikrokolónovej chromatografie až po semipreparatívnu a preparatívnu.

Surveyor PDA detektor je najcitlivejší zo všetkých HPLC detektorov s diódovým poľom. Optika s dvojlampovým zdrojom bezproblémovo pokrýva celý rozsah vlnových dĺžok od 190 do 800 nm. Tvarovač svetelného lúča z optických vlákien poskytuje vynikajúce optické rozlíšenie bez obetovania citlivosti.

Geodet RI refraktometrický detektor s termostatovanou kyvetou minimálneho objemu s plne elektronickým ovládaním z počítača.

Geodet FL fluorometrický skenovací detektor s najvyššou citlivosťou a schopnosťou detekovať fluorescenciu, chemiluminiscenciu a fosforescenciu.

Široký výber autosamplerov vám umožňuje pracovať s konvenčnými liekovkami a 96-polohovými platňami, ktoré sa široko používajú v biochémii a klinickej praxi... Prácu s nimi uľahčuje použitie podobných doštičiek na prípravu vzoriek extrakciou tuhou fázou.

Elektrický pohon 400, slučka Valco (20 µl - štandard) s možnosťou čiastočného doplnenia.

Kolotoč 96 vzoriek.

Elektrický pohon, kolónová pec, slučka Valco (100 μL - štandard) s možnosťou čiastočného naplnenia Režim AutoMix na prípravu vzorky. Kolotoč na vzorky: 84 x 2 ml (vzorky) + 3x 10 ml (reagencie). Vstavaný stĺpový termostat. 420

Slučkový autosampler pre výskumnú prácu so schopnosťou pracovať v režime plného, čiastočného naplnenia a mikrolitrového vstrekovania vzorky. Široká ponuka karuselov (štandard - 96 vzoriek).

Tabletový autosampler pre prácu s 96- a 384-polohovými tabletmi. Vstrekovanie vzorky do slučky pod tlakom, možnosť vstreknutia vzoriek menších ako 1 μL. Možnosť inštalácie valníkového podávača. HPLC

Významní výrobcovia zariadení HPLC

· Waters - supervýkonná chromatografia, hmotnostná spektrometria, kolóny, extrakcia na pevnej fáze;

Varian, Inc. - chromatografy a kolóny, príslušenstvo na extrakciu tuhou fázou;

Agilent Technologies - chromatografy a kolóny;

· Hypersil - kolóny a sorbenty.

Merck KGaA - TLC platne a príslušenstvo pre TLC, kolóny, sorbenty, mobilné fázy pre HPLC, príslušenstvo pre extrakciu tuhou fázou

· Dionex - zariadenia a kolóny pre HPLC, najmä pre iónovú chromatografiu.

Literatúra

1.Pilipenko A.T., Pjatnický I.V. Analytická chémia. V dvoch knihách: kniha 1 - M .: Chemistry, 1990, -480s.

1. Pilipenko A.T., Pjatnický I.V. Analytická chémia. V dvoch knihách: kniha 2 - M .: Chemistry, 1990, -480s.

2. Vasiľjev V.P. Analytická chémia. Za 2 hodiny, 2. časť. Fyzikálno-chemické metódy analýzy: Učebnica. pre Khimko - technol. špecialista. univerzity. - M .: Vyššie. shk., 1989. - 384s.

3. Hydrochemické materiály. Ročník 100. Metódy a technické prostriedky prevádzkového monitorovania kvality povrchových vôd. L .: Gidrometeo-Izdat, 1991 .-- 200. roky.

4. Lurie Yu.Yu. Analytická chémia priemyselných odpadových vôd / Yu.Yu. Lurie; M.: Khimiya, 1984.-- 448s.

5. Ewing G. Inštrumentálne metódy chemickej analýzy / Per. z angličtiny M .: Mir, 1989 .-- 348 s.

6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. Monitorovanie životného prostredia. V 2 zväzkoch SPb .: Vianoce. 2000 .-- 260 str.

7. Aivazov B.V. Úvod do chromatografie. M.: Vyššie. shk., 1983 .-- 450 s.

8. Goldberg K.A., Vigdergauz M.S. Úvod do plynovej chromatografie. M.: Chémia, 1990.-- 329 s.

9. Stolyarov B.V. et al. // Praktická plynová a kvapalinová chromatografia. SPb.: SPbGU, 1998.-- S. 81.

11. Gorshkov A.G., Marinait I.I. HPLC - metóda na monitorovanie PAU v objektoch životného prostredia

12. Torosyan G.O., Martirosyan V.A., Aleksanyan A.R., Zakaryan M.O. Odstránenie anilínu z vodných roztokov pomocou odpadovej aluminotermickej redukcie valcovaných medených okují

13. L.A. Turkina, G.N. Koroleva Vývoj metódy na stanovenie prvkov alkalických zemín a horčíka iónovou vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou

14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. Analýza komplexov kadmia v životnom prostredí

Aplikácia

STANOVENIE KLOMAZÓNU VO VODE CHROMATOGRAFICKÝMI METÓDAMI

METODICKÉ POKYNY MUK 4.1.1415-03

1. Vypracoval: Federal vedecké centrum ich hygienu. F.F.

Erisman; Moskovská poľnohospodárska akadémia. K.A.

Timiryazev; za účasti Oddelenia štátneho sanitárneho a epidemiologického dohľadu Ministerstva zdravotníctva Ruska. Vývojári metódy sú uvedení na konci.

3. Schvaľuje hlavný štátny sanitár

Za Ruskú federáciu prvý námestník ministra zdravotníctva Ruskej federácie akad. RAMS G.G. Oniščenko 24. júna 2003

5. Prvýkrát predstavený.

1. Úvodná časť

Výrobca: FMS (USA).

Obchodné meno: COMMAND.

Účinná látka: klomazon.

2-(2-chlórbenzyl)-4,4-dimetyl-3-izoxalidín-3-ón (IUPAC)

Svetlohnedá viskózna kvapalina.

Teplota topenia: 25 °C.

Teplota varu: 275 °C.

Tlak pár pri 25 °C: 19,2 MPa.

Rozdeľovací koeficient n-oktanol/voda: K logP = 2,5.

Necháme dobre rozpustiť v acetóne, hexáne, etanole, metanole,

chloroform, dichlórmetán a acetonitril; rozpustnosť vo vode -

1,10 g / cm3 dm. Stabilný pri izbovej teplote najmenej 2 roky, pri 50 -C - najmenej 3 mesiace.

Stručná toxikologická charakteristika: Akútne orálne

toxicita (LD) pre potkany - 1369 - 2077 mg / kg; akútna dermálna

toxicita (LD) pre potkany - viac ako 2000 mg / kg; akútna

inhalačná toxicita (LC) pre potkany - 4,8 mg / cu. dm (4 h).

Hygienické normy. MPC vo vode - 0,02 mg / meter kubický dm.

Rozsah lieku. Clomazone je selektívny herbicíd používaný na ničenie obilných a dvojklíčnolistových burín v sóji a ryži s aplikáciou pred vzídením alebo pred sejbou.

2. Metóda stanovenia klomazónu vo vode

chromatografické metódy

2.1. Základné ustanovenia

2.1.1. Princíp metódy

Technika je založená na extrakcii clomazonu z analyzovanej vzorky hexánom, zahustení extraktu a následnom kvantitatívnom stanovení alternatívnymi metódami:

vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) s

UV detektor, plynová kvapalinová chromatografia (GLC) s detektorom konštantnej rýchlosti rekombinácie alebo chromatografia na tenkej vrstve (TLC). Kvantitatívne stanovenie sa vykonáva metódou absolútnej kalibrácie.

2.1.2. Selektivita metódy

Metóda je v navrhnutých podmienkach špecifická v prítomnosti globálnych environmentálnych polutantov: chlórových derivátov cykloparafínov (HCH izoméry), difenylových zlúčenín (DDT a jeho deriváty), ich metabolitov - polychlórovaných benzénov a fenolov, ako aj v prítomnosti trichlóracetát sodný, ktorý možno použiť na plodiny ako herbicíd.

2.1.3. Metrologické charakteristiky metódy (P = 0,95)

Činidlá, roztoky a materiály

Clomazone s obsahom d.v. 99,8 %

(FMS, USA)

Dusík, alebo GOST 9293-79

Amoniakálna voda, 25%, h GOST 1277-81

Acetón, h GOST 2603-79

n-Hexán, h GOST 2603-79

Peroxid vodíka, 30% vodný roztok GOST 10929-77

Izopropylalkohol, reagenčná trieda TU 6-09-402-75

Kyselina sírová, chemicky čistá GOST 4203-77

Kyselina chlorovodíková (chlorovodíková), stupeň činidla GOST 3118-77

Metylalkohol, reagenčná trieda GOST

Hydroxid sodný, chemicky čistý, 25% vodný roztok GOST 4323-77

Bezvodý síran sodný, akosť činidla GOST 1277-81

Dusičnan strieborný, reagenčná trieda GOST 1277-81

2-Fenoxymetanol, h TU 6-09-3688-76

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 – 0,20 mm)

s 5 % SE-30, Hemapol, Česká republika

Chromaton N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 mm) s 1,5

ОV-17 + 1,95 % QF-1, Hemapol, Česká republika

Doštičky pre HPTLC (ZSSR)

Dosky "Kieselgel 60 F-254" (Nemecko)

Rekordy "Silufol" Česká republika

Papierové filtre "biela páska", bez popola a predprané hexánom TU 6-09-2678-77

2.3. Prístroje, prístroje, riad

Kvapalinový chromatograf Milichrom

s ultrafialovým detektorom

Oceľová chromatografická kolóna,

dĺžka 64 mm, vnútorný priemer 2 mm,

plnené Silasorbom 600, zrnitosť 5 mikrónov

Plynový chromatograf radu "Farebný" príp

podobné, vybavené konštantným detektorom

rýchlosť rekombinácie (RPR) s limitom

detekcia lindanu 4 x 10 g / cm3. cm

Sklenená chromatografická kolóna, dĺžka

1 alebo 2 m, vnútorný priemer 2 - 3 mm

Mikrostriekačka, typ MSh-10, s objemom 10 μl TU 5E2-833-024

Trepačka, typ AVU-6s TU 64-1-2851-78

Voda do kúpeľa TU 64-1-2850-76

Analytické váhy, typ VLA-200 GOST 34104-80E

Chromatografická komora GOST 10565-74

Vodné prúdové čerpadlo GOST 10696-75

Ortuťovo-kremenný žiarič OKN-11 TU 64-1-1618-77

Rozprašovače skla GOST 10391-74

Rotačná vákuová odparka IR-1M

alebo podobný TU 25-11-917-76

Kompresorová jednotka TU 64-1-2985-78

Sušiaca skriňa TU 64-1-1411-76E

Oddeľovacie lieviky GOST 3613-75

Odmerné banky s objemom 100 ml GOST 1770-74

Odmerné valce s objemom 10, 50 ml GOST 1770-74E

Banky hruškovitého tvaru s tenkou časťou,

s kapacitou 100 ml GOST 10394-72

Kužeľové banky s objemom 100 ml GOST 22524-77

Odstredivé skúmavky, objemové GOST 25336-82E

Pipety s kapacitou 0,1, 1, 2, 5 a 10 ml GOST 20292-74

Lieviky chemické, kužeľové, priem

34 - 40 mm GOST 25336-82E

2.4. Výber vzorky

Odber vzoriek, skladovanie a príprava vzoriek sa vykonáva v súlade s

"Jednotné pravidlá pre odber vzoriek poľnohospodárskych produktov, potravín a objektov životného prostredia na stanovenie stopových množstiev pesticídov", schválené N 2051-79 zo dňa 21.8.

Odobraté vzorky je možné uchovávať v chladničke až 5 dní. Pred analýzou sa voda (ak je suspendovaná) prefiltruje cez voľný papierový filter.

2.5. Príprava na určenie

2.5.1. HPLC metóda

2.5.1.1. Príprava mobilnej fázy pre HPLC

Do odmernej banky s objemom 100 ml sa pipetou vloží 5 ml izopopanolu a 5 ml metanolu, pridá sa po značku hexánom, premieša sa, prefiltruje.

2.5.1.2. Kondicionovanie stĺpcov

Premývajte HPLC kolónu zmesou hexán-metanol-izopropanol (90:5:5, obj./obj.) počas 30 minút. pri rýchlosti dávkovania rozpúšťadla 100 μl / min.

2.5.2. GLC metóda. Príprava a kondicionovanie kolóny

Hotová náplň (5% SE-30 na Chromaton N-AW-DMCS) sa naleje do sklenenej kolóny, utesní sa vo vákuu, kolóna sa nainštaluje do termostatu chromatografu bez pripojenia k detektoru a stabilizuje sa v prúde dusíka pri pri teplote 250 °C počas 10 - 12 h.

2.5.3. TLC metóda

2.5.3.1. Príprava vyvíjacích činidiel

2.5.3.1.1. Vyvolávacie činidlo N 1

1 g dusičnanu strieborného sa rozpustí v 1 ml destilovanej vody, pridá sa 10 ml 2-fenoxymetanolu, 190 ml acetónu, 1 - 2 kvapky peroxidu vodíka, roztok sa premieša a prenesie do fľaše z tmavého skla.

2.5.3.2.2. Vyvolávacie činidlo N2

V 100 ml odmernej banke sa rozpustí 0,5 g dusičnanu strieborného v 5 ml destilovanej vody, pridá sa 10 ml 25 % vodného amoniaku, roztok sa doplní acetónom na 100 ml, premieša sa a prenesie do fľaše z tmavého skla.

2.5.3.2. Príprava mobilnej fázy pre TLC

Do odmernej banky s objemom 100 ml pridajte 20 ml acetónu a pridajte hexán po značku, premiešajte. Zmes sa naleje do chromatografickej komory s vrstvou nie väčšou ako 6 - 8 mm za 30 minút. Pred chromatografiou.

2.5.4. Príprava štandardných roztokov

Základný štandardný roztok klomazonu s obsahom 100 μg/ml sa pripraví rozpustením 0,010 g prípravku s obsahom 99,8 % ai v hexáne v 100 ml odmernej banke. Roztok sa uchováva v chladničke mesiac.

Pracovné štandardné roztoky s koncentráciou 0,4; 1,0; 2,0; 4,0; 10,0; 20 a 40,0 ug/ml sa pripraví zo zásobného štandardného roztoku klomazónu vhodným sériovým riedením hexánom.

Pracovné roztoky sa uchovávajú v chladničke nie dlhšie ako mesiac.

2.5.5. Zostavenie kalibračného grafu

2.5.5.1. Kalibračná tabuľka A (meranie podľa článku 2.7.1, HPLC)

Na zostavenie kalibračného grafu sa do injektora chromatografu vstrekne 5 μl pracovného štandardného roztoku klomazónu s koncentráciou 4,0; 10,0; 20,0 a 40 μg/ml.

2.5.5.2. Kalibračný graf B (meranie podľa článku 2.7.2, GLC)

Na vytvorenie kalibračného grafu sa 5 ul pracovného štandardného roztoku klomazónu s koncentráciou 0,4 vstrekne do chromatografického odparovača; 1,0; 2,0; 4.0 a 10.0.

Vykonajte aspoň 5 paralelných meraní. Nájdite priemernú hodnotu výšky chromatografického píku pre každú koncentráciu. Kalibračný graf (A alebo B) je vynesený ako funkcia výšky chromatografického píku v mm na koncentrácii klomazónu v roztoku v μg/ml.

2.6. Popis definície

100 ml analyzovanej vzorky vody sa umiestni do oddeľovacieho lievika s objemom 250 ml, prileje sa 10 ml 25 % vodného roztoku hydroxidu sodného, premieša sa a pridá sa 20 ml n-hexánu. Lievik sa pretrepáva 3 minúty, po oddelení fáz sa hexánová vrstva naleje do hruškovitej banky s objemom 100 ml a prechádza cez vrstvu bezvodého síranu sodného umiestnenú v kónickom lieviku na preloženom papieri. filter. Extrakcia liečiva z vodnej vzorky sa opakuje ešte dvakrát, vždy s použitím 20 ml n-hexánu. Spojené hexánové extrakty sa odparia na rotačnej vákuovej odparke pri teplote 40 °C takmer do sucha, zvyšok sa odfúkne prúdom vzduchu alebo dusíka vysokej čistoty. Suchý zvyšok sa rozpustí v 0,1 ml (HPLC, TLC) alebo 0,25 ml (GLC) n-hexánu a analyzuje sa jednou z chromatografických metód.

2.7. Chromatografické podmienky

Kvapalinový chromatograf Milichrom s ultrafialovým detektorom (Rusko).

Oceľový stĺp dlhý 64 mm, vnútorný priemer 2 mm,

plnené Silasorbom 600, zrnitosť 5 mikrónov.

Teplota kolóny: izbová teplota.

Mobilná fáza: hexán-izopropanol-metanol (90:5:5, obj./obj.).

Prietok eluentu: 100 μl / min.

Pracovná vlnová dĺžka: 240 nm.

Citlivosť: 0,4 jednotky absorpcia na stupnici.

Objem vstreknutej vzorky: 5 μl.

Čas uvoľnenia Clomazone: približne 6 minút.

Lineárny rozsah detekcie: 20 - 200 ng.

Vzorky s píkmi väčšími ako 40 μg/ml štandardného roztoku sa zriedia mobilnou fázou HPLC.

Plynový chromatograf "Tsvet-570" s detektorom konštantnej rýchlosti rekombinácie iónov.

Sklenená kolóna s dĺžkou 1 m, vnútorným priemerom 3 mm, naplnená Chromatonom N-AW-DMCS s 5 % SE-30 (0,16 - 0,20 mm).

Pracovná stupnica elektromera je 64 x 10 10 Ohm.

Rýchlosť magnetofónu je 200 mm/h.

Teplota kolónovej pece - 190 -C

detektor - 300 -C

výparník - 220 -C

Prietok nosného plynu (dusíka) - 60 ml / min.

Objem vstreknutej vzorky je 5 μl.

Čas uvoľňovania klomazonu je 2,5 minúty.

Lineárny rozsah detekcie: 2 - 50 ng.

Vzorky s píkmi väčšími ako 10 μg/ml štandardného roztoku sa zriedia hexánom.

Na zlepšenie presnosti identifikácie klomazónu v prítomnosti gama-HCH, ktorý má blízky retenčný čas, sa klomazón zo vzorky odstráni pôsobením koncentrovanej kyseliny sírovej. Opätovná analýza vzorky umožňuje stanoviť príspevok klomazónu k primárnemu chromatografickému signálu.

Roztok hexánu v banke získaný kvantitatívne podľa bodu 2.6

(alebo jeho alikvót) sa nanesie na chromatografické platne „Silufol“, „Kieselgel 60F-254“ alebo „Plates for HPTLC“. Štandardné roztoky sa aplikujú vedľa seba v objeme zodpovedajúcom obsahu klomazónu 1, 2, 5 a 10 μg. Platňa sa umiestni do chromatografickej komory obsahujúcej zmes n-hexán-acetón (4:1 objemovo). Po vyvolaní chromatogramu sa platňa vyberie z komory, umiestni sa pod prievan, kým sa rozpúšťadlá neodparia, potom sa spracuje s jedným z vyvolávacích činidiel a umiestni sa pod ultrafialovú lampu na 5 minút. Zóna lokalizácie liečiva na platniach Silufol, HPTLC a Kizelgel 60F-254 sa javí ako šedo-hnedé škvrny s hodnotami Rf 0,35, 0,85 a 0,43. Na stanovenie clomazonu pomocou TLC môžete použiť platne "Alugram" a "Polygram" (vyrobené v Nemecku). Hodnoty Rf klomazónu na týchto platniach sú 0,37 a 0,38.

3. Bezpečnostné požiadavky

Pri práci s organickými rozpúšťadlami, toxickými látkami, elektrickými vykurovacími zariadeniami je potrebné dodržiavať všeobecne uznávané bezpečnostné pravidlá.

4. Kontrola chyby merania

Prevádzková kontrola chyby merania a reprodukovateľnosti sa vykonáva v súlade s odporúčaniami MI 2335-95. GSI "Interná kontrola kvality výsledkov kvantitatívnej chemickej analýzy".

5. Vývojári

Yudina T.V., Fedorová N.E. (FNTSG pomenovaná po F.F. Erismanovi).

E. I. Davidyuk (UkrNIIGINTOKS, Kyjev); Kisenko M.A., Demčenko V.F. (Ústav pracovného lekárstva Akadémie vied a Akadémie lekárskych vied Ukrajiny, Kyjev).

Kvapalinová chromatografia Je to metóda na separáciu a analýzu komplexných zmesí látok, v ktorých kvapalina slúži ako mobilná fáza. Je použiteľná na separáciu širšieho spektra látok ako metóda plynovej chromatografie. Je to spôsobené tým, že väčšina látok nie je prchavá, mnohé z nich sú pri vysokých teplotách nestabilné (najmä zlúčeniny s vysokou molekulovou hmotnosťou) a pri premene do plynného stavu sa rozkladajú. Separácia látok kvapalinovou chromatografiou sa najčastejšie vykonáva pri izbovej teplote.

Zvláštnosti všetkých typov kvapalinovej chromatografie sú spôsobené skutočnosťou, že mobilná fáza v nej je kvapalina a sorpcia zložiek z plynného a kvapalného eluentu prebieha rôznymi spôsobmi. Ak pri plynovej chromatografii plní nosný plyn iba transportnú funkciu a nie je adsorbovaný stacionárnou fázou, potom je kvapalná mobilná fáza v kvapalinovej chromatografii aktívnym eluentom, jej molekuly môžu byť adsorbované stacionárnou fázou. Pri prechode kolónou musia molekuly zložiek analyzovanej zmesi v eluente vytesniť molekuly eluentu z povrchovej vrstvy sorbentu, čo vedie k zníženiu energie interakcie molekúl analytu s povrchu sorbentu. Preto hodnoty zadržaných objemov V Rúmerné zmene voľnej energie systému sú v kvapalinovej chromatografii menšie ako v plynovej chromatografii a rozsah linearity sorpčnej izotermy v kvapalinovej chromatografii je širší.

Použitím rôznych eluentov je možné meniť retenčné parametre a selektivitu chromatografického systému. Selektivita v kvapalinovej chromatografii, na rozdiel od plynovej, nie je určená jedným, ale dvoma faktormi - povahou mobilnej (eluentnej) a stacionárnej fázy.

Kvapalná mobilná fáza má vyššiu hustotu a viskozitu ako plynná, difúzne koeficienty D f o 3-4 rády nižšie ako v plyne. To vedie k spomaleniu prenosu hmoty v kvapalinovej chromatografii v porovnaní s plynovou chromatografiou. Van Deemterova rovnica vzhľadom k tomu, že člen V nezohráva úlohu v kvapalinovej chromatografii ( D f  D G), je upravená aj grafická závislosť účinnosti H na lineárnej rýchlosti toku mobilnej fázy má tvar znázornený na obr. 1.9.

V klasickej verzii kvapalinovej stĺpcovej chromatografie sa analyzovaná vzorka rozpustená v eluente zavedie do sklenenej kolóny vysokej 1–2 m, naplní sa sorbentom s veľkosťou častíc 100 µm a eluentom a eluent sa nechá prejsť cez odoberaním častí eluátu z kolóny. Tento variant kvapalinovej chromatografie sa stále používa v laboratórnej praxi, ale keďže rýchlosť prechodu eluentu pod vplyvom gravitácie je nízka, analýza je zdĺhavá.

Moderná verzia kvapalinovej chromatografie, tzv. vysokoúčinná kvapalinová chromatografia HPLC, využíva volumetrické a povrchovo porézne sorbenty s veľkosťou častíc 5–10 µm, vstrekovacie čerpadlá, ktoré zabezpečujú tlak v systéme až 400 atm., A vysoko citlivé detektory. Rýchly prenos hmoty a vysoká separačná účinnosť umožňujú použitie HPLC na molekulárnu separáciu (kvapalinová adsorpcia a kvapalinová kvapalinová deliaca chromatografia), na iónovú separáciu (iónová výmenná, iónová, iónovo-párová chromatografia), na separáciu makromolekúl (vylučovanie podľa veľkosti chromatografia).

1.3. ZADRŽANIE A SILA ROZPÚŠŤADLA

Aby sa analyty separovali na kolóne, ako je uvedené vyššie, kapacitný faktor k" musí byť väčší ako 0, to znamená, že látky musia byť zadržané stacionárnou fázou, sorbentom. Kapacitný faktor však nesmie byť príliš veľké na získanie prijateľného elučného času. Ak sa pre danú zmes látok vyberie stacionárna fáza, ktorá ich zadrží, potom ďalšia práca na vývoji analytickej metódy spočíva vo výbere rozpúšťadla, ktoré by v ideálnom prípade poskytovalo iné všetky komponenty, ale prijateľne nie príliš veľké k ". To sa dosiahne zmenou elučnej sily rozpúšťadla.

Pri adsorpčnej chromatografii na silikagéli alebo alumine sa spravidla sila dvojzložkového rozpúšťadla (napríklad hexán s prídavkom izopropanolu) zvyšuje zvýšením obsahu polárnej zložky (izopropanol), príp. znížená znížením obsahu izopropanolu. Ak je obsah polárnej zložky príliš nízky (menej ako 0,1 %), mala by byť nahradená slabšou z hľadiska elučnej sily. To isté sa vykoná nahradením buď polárnych alebo nepolárnych zložiek inými, aj keď tento systém neposkytuje požadovanú selektivitu vzhľadom na zložky zmesi, o ktoré je záujem. Pri výbere systémov rozpúšťadiel sa berú do úvahy tak rozpustnosti zložiek zmesi, ako aj eluotropné série rozpúšťadiel zostavené rôznymi autormi.

Približne rovnakým spôsobom sa sila rozpúšťadla volí v prípade použitia očkovaných polárnych fáz (nitril, amino, diol, nitro atď.), pričom sa berie do úvahy možná chemické reakcie a s vylúčením fázovo nebezpečných rozpúšťadiel (napr. aldehydov a ketónov pre amínovú fázu).

V prípade chromatografie na reverznej fáze sa sila rozpúšťadla zvýši zvýšením organickej zložky (metanol, acetonitril alebo THF) v eluente a zníži sa pridaním väčšieho množstva vody. Ak nie je možné dosiahnuť požadovanú selektivitu, použite inú organickú zložku alebo ju skúste zmeniť pomocou rôznych prísad (kyseliny, iónové párové činidlá atď.).

Pri separáciách iónomeničovou chromatografiou sa sila rozpúšťadla mení zvýšením alebo znížením koncentrácie tlmivého roztoku alebo zmenou pH, v niektorých prípadoch sa používa modifikácia organickými látkami.

Najmä v prípade zložitých prírodných a biologických zmesí však často nie je možné zvoliť silu rozpúšťadla tak, aby sa všetky zložky vzorky eluovali v primeranom čase. Potom sa treba uchýliť k gradientovej elúcii, t.j. použiť rozpúšťadlo, ktorého elučná sila sa počas analýzy mení tak, že sa neustále zvyšuje podľa vopred určeného programu. Táto technika umožňuje dosiahnuť elúciu všetkých zložiek komplexných zmesí v relatívne krátkom čase a ich rozdelenie na zložky vo forme úzkych píkov.

1.6.1. Adsorpčná kvapalinová chromatografia... Adsorpčná kvapalinová chromatografia, v závislosti od polarity stacionárnej a mobilnej fázy, sa ďalej delí na chromatografiu s normálnou fázou (NPC) a chromatografiu s reverznou fázou (RPC). V NPH sa používa polárny adsorbent a nepolárne mobilné fázy, v RPC nepolárny adsorbent a polárne mobilné fázy, pri oboch variantoch je však často dôležitejší výber mobilnej fázy ako výber stacionárnej. Stacionárna fáza musí zadržať látky, ktoré sa majú oddeliť. Mobilná fáza, to znamená rozpúšťadlo, musí poskytovať rôzne kapacity kolóny a účinnú separáciu v primeranom čase.

Ako stacionárna fáza v adsorpčnej kvapalinovej chromatografii sa používajú polárne a nepolárne jemne rozptýlené porézne materiály so špecifickým povrchom viac ako 50 m 2 / g. Polárne adsorbenty (SiO 2, Al 2 O 3, Florisil a pod.) majú na povrchu slabo kyslé skupiny, ktoré dokážu zadržiavať látky so zásaditými vlastnosťami. Tieto adsorbenty sa používajú najmä na separáciu nepolárnych a stredne polárnych zlúčenín. Ich nevýhodou je vysoká citlivosť na obsah vody v aplikovaných eluentoch. Na odstránenie tohto nedostatku sa polárne sorbenty upravujú s amínmi, diolmi a inými činidlami, čo vedie k povrchovému očkovaniu týchto činidiel, modifikácii povrchu a zmene selektivity vzhľadom na analyty.

Nepolárne adsorbenty (grafitizované sadze, diatomit, kremelina) sú neselektívne voči polárnym molekulám. Na získanie nepolárnych adsorbentov sa nepolárne skupiny, napríklad alkylsilyl SiR 3, kde R sú C2 C22 alkylové skupiny, často navrúbľujú na povrch, napríklad silikagélu.

Mobilná fáza musí úplne rozpustiť analyzovanú vzorku, mať nízku viskozitu (aby boli difúzne koeficienty dostatočne veľké), je žiaduce, aby z nej bolo možné izolovať oddelené zložky. Mal by byť inertný voči materiálom všetkých častí chromatografu, bezpečný, lacný, vhodný pre detektor.

Mobilné fázy používané v kvapalinovej chromatografii sa líšia svojou elučnou silou. Elučná sila rozpúšťadla ukazuje, koľkokrát je sorpčná energia daného eluentu na danom adsorbente väčšia ako sorpčná energia eluentu vybraného ako štandard, napríklad n-heptánu. Slabé rozpúšťadlá sú slabo adsorbované stacionárnou fázou, preto sú distribučné koeficienty sorbovaných látok (sorbátov) vysoké. Naopak, silné rozpúšťadlá sa dobre adsorbujú, takže distribučné koeficienty sorbátu sú nízke. Rozpúšťadlo je tým silnejšie, čím je v ňom vyššia rozpustnosť analyzovanej vzorky, tým silnejšia je interakcia medzi rozpúšťadlom a sorbátom.

Na zabezpečenie vysokej účinnosti separácie na kolóne je potrebné zvoliť mobilnú fázu, ktorá má polaritu optimálnu pre separovanú zmes za zvolených separačných podmienok. Zvyčajne sa najprv vyberie stacionárna fáza, ktorá má polaritu blízku polarite zložiek, ktoré sa majú oddeliť. Potom sa vyberie mobilná fáza, čím sa zabezpečí, že kapacitný faktor k" sa ukázalo byť v rozsahu od 2 do 5. Ak je polarita mobilnej fázy príliš blízka polarite stacionárnej fázy, čas zdržania komponentov bude príliš krátky a ak polarity mobilnej a stacionárnej fázy fázy sa príliš líšia, retenčný čas je príliš dlhý.

Pri výbere mobilných fáz sa riadime takzvaným eluotropným radom založeným na použití indexov polarity. Snyder R", ktorý rozdeľuje všetky rozpúšťadlá na silné (polárne) a slabé (slabo polárne a nepolárne). Stupnica polarity je založená na rozpustnosti látok používaných ako mobilné fázy v dioxáne, nitrometáne a etanole.

Tabuľka 1.2 ukazuje hodnoty indexov polarity a elučnej sily (vzhľadom na Si02) pre množstvo rozpúšťadiel najčastejšie používaných ako mobilné fázy v kvapalinovej chromatografii. Sú tu tiež uvedené limity priehľadnosti pre krátke vlnové dĺžky týchto rozpúšťadiel, čo uľahčuje výber podmienok na detekciu zložiek zmesi.

Tabuľka 1.2

Charakteristika rozpúšťadiel používaných v kvapalinovej chromatografii

Solventný	Index polarity	Elučná sila (SiO 2)	Krátkovlnný okraj priehľadnosti
Fluóralkán
cyklohexán
n-Hexán
tetrachlórmetán
Diizopropyléter

dietyléter
dichlórmetán
tetrahydrofurán
chloroform

Octová kyselina


acetonitril
nitrometán

Kvapalinová chromatografia často nepoužíva jednotlivé rozpúšťadlá, ale ich zmesi. Často malé pridanie iného rozpúšťadla, najmä vody, výrazne zvýši elučnú silu eluentu.

Pri separácii viaczložkových zmesí nemusí jedna mobilná fáza ako eluent oddeliť všetky zložky vzorky v primeranom čase. V tomto prípade sa používa metóda stupňovitej, alebo gradientovej elúcie, pri ktorej sa pri chromatografii postupne používa stále viac silných eluentov, čo umožňuje elúciu vysoko retenčných látok v kratšom čase.

V kvapalinovej chromatografii sú niektoré empirický pravidlá, ktoré sú veľmi užitočné pri výbere eluentu:

 sorpcia zlúčeniny sa spravidla zvyšuje so zvyšujúcim sa počtom dvojitých väzieb a OH-skupín v nej;

 sorpcia klesá v rade organických zlúčenín: kyseliny  alkoholy aldehydy ketóny estery nenasýtené uhľovodíky nasýtené uhľovodíky;

 Chromatografia na normálnej fáze sa používa na separáciu látok rôznych polarít a separáciu látok rôznych tried: analyzovaná vzorka sa rozpustí a eluuje nepolárnym eluentom, zlúčeniny rôznych tried opúšťajú kolónu s polárnym adsorbentom po rôzne časy, pričom retenčný čas zlúčenín s rôznymi funkčnými skupinami sa zvyšuje pri prechode z nepolárnych spojení na slabo polárne. Pre veľmi polárne molekuly sú retenčné časy také dlhé, že analýza nie je možná s nepolárnym eluentom. Aby sa skrátila doba zdržania polárnych zložiek, prechádzajú na polárne eluenty;

 pri variante s reverznou fázou stacionárna fáza (nepolárny adsorbent) silnejšie adsorbuje nepolárnu zložku z polárnych eluentov, napr. z vody;

 Znížením polarity eluentu pridaním menej polárneho rozpúšťadla je možné znížiť retenciu zložiek.

1.6.2. Distribučná kvapalinová chromatografia. V distribučnej alebo kvapalinovej chromatografii je oddelenie zložiek analyzovanej vzorky spôsobené rozdielmi v koeficientoch ich distribúcie medzi dvoma nemiešateľnými kvapalnými fázami, z ktorých jedna je stacionárna a nachádza sa na povrchu alebo v póroch pevný stacionárny nosič a druhý je mobilný.

Charakterom síl interakcie, ktoré určujú rozdielnu distribúciu medzi dvoma fázami látok líšiacich sa chemickou štruktúrou, je distribučná chromatografia podobná adsorpcii, teda aj tu je separácia založená na rozdiele síl intermolekulárna interakcia zložiek analyzovanej vzorky so stacionárnou a mobilnou kvapalnou fázou.

V závislosti od techniky uskutočnenia môže byť deliaca chromatografia, podobne ako adsorpčná chromatografia, stĺpcová alebo plochá (papierová alebo tenkovrstvová).

Ako tuhé nosiče sa používajú látky, ktoré sú indiferentné voči mobilnému rozpúšťadlu a zložkám analyzovanej vzorky, ale sú schopné udržať stacionárnu fázu na povrchu a v póroch. Najčastejšie sa ako nosiče používajú polárne látky (celulóza, silikagél, škrob). Aplikuje sa na ne stacionárna fáza  polárne rozpúšťadlo, najčastejšie voda alebo alkohol. V tomto prípade sa ako mobilné fázy používajú menej polárne alebo nepolárne látky (alkoholy, amíny, ketóny, uhľovodíky atď.). Tento variant deliacej chromatografie sa nazýva normálna fáza... Používa sa na oddelenie polárnych látok.

Druhý variant deliacej chromatografie sa líši tým, že ako stacionárna tuhá fáza sa používajú nepolárne nosiče (kaučuk, fluoroplast, hydrofobizovaný silikagél), ako stacionárna kvapalná fáza sa používajú nepolárne rozpúšťadlá (uhľovodíky) a ako stacionárna kvapalná fáza sa používajú polárne rozpúšťadlá (alkoholy). aldehydy, ketóny atď., často voda). Tento variant deliacej chromatografie sa nazýva obrátená fáza a používa sa na separáciu nepolárnych látok.

Na dosiahnutie optimálnej separácie zložiek analyzovanej vzorky je veľmi dôležitý výber mobilnej fázy. Rozpúšťadlá (mobilné a stacionárne kvapalné fázy) by sa mali vyberať tak, aby sa distribučné koeficienty zložiek zmesi dostatočne líšili. Nasledujúce sú uvedené pre kvapalné fázy požiadavky:

1) použité rozpúšťadlá by mali dobre rozpúšťať látky, ktoré sa majú oddeliť, a ich rozpustnosť v stacionárnej fáze by mala byť väčšia ako v mobilnej fáze;

2) rozpúšťadlá používané ako mobilná a stacionárna fáza musia byť vzájomne saturovateľné, to znamená, že zloženie rozpúšťadla musí byť pri prechode kolónou konštantné;

3) interakcia rozpúšťadiel používaných ako mobilná fáza so stacionárnou fázou by mala byť minimálna.

Najčastejšie sa pri deliacej kvapalinovej chromatografii ako mobilné kvapalné fázy nepoužívajú jednotlivé látky, ale ich zmesi v rôznych pomeroch. To umožňuje regulovať polaritu mobilnej fázy, meniť pomer polarít mobilnej a stacionárnej fázy a dosiahnuť optimálne separačné podmienky pre zložky konkrétnej analyzovanej zmesi.

Významnou nevýhodou tejto chromatografickej metódy je pomerne rýchle vymývanie nanesenej stacionárnej kvapalnej fázy z nosiča. Na jej odstránenie sa rozpúšťadlo použité ako mobilná fáza nasýti látkou použitou ako stacionárna kvapalná fáza alebo sa stacionárna kvapalná fáza stabilizuje jej naočkovaním na nosič.

Typ deliacej kvapalinovej chromatografie je široko používaná metóda HPLC.

Najbežnejšie chromatografické systémy sú tie s modulárnym princípom zostavy. Ako samostatné moduly sú k dispozícii čerpadlá, odplyňovacie zariadenia, detektory, dávkovače (autosamplery), stĺpcové termostaty, zberače frakcií, riadiace jednotky chromatografického systému a záznamové zariadenia. Široká škála modulov umožňuje flexibilne riešiť rôzne analytické úlohy, v prípade potreby rýchlo meniť konfiguráciu systému s minimálnymi nákladmi. Zároveň sa vyrábajú aj monomodulárne (integrované) LC, ktorých hlavnou výhodou je miniaturizácia jednotlivých blokov a kompaktnosť zariadenia.

V závislosti od spôsobu elúcie sa kvapalinové chromatografy delia na izokratické a gradientové.

Schematický diagram izokratického chromatografu

Mobilná fáza z nádobky (1) cez vstupný filter (9) je privádzaná presným vysokotlakovým čerpadlom (2) do systému na vnášanie vzorky (3) - ručný injektor alebo autosampler a tam je vstrekovaná vzorka. . Potom cez in-line filter (8) vzorka s prúdom mobilnej fázy vstupuje do separačného prvku (prvkov) (4) - cez ochrannú kolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a je odstránený do odtokovej nádoby (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaregistruje a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od vyhotovenia funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (zvyčajne ovládač čerpadla alebo systému), z klávesníc každého z modulov systému alebo riadiacim programom z osobného počítača.

V prípade gradientovej elúcie sa používajú dva zásadne odlišné typy kvapalinových chromatografov. Líšia sa bodom vzniku gradientu zloženia mobilnej fázy.

Schéma gradientového chromatografu s tvorbou gradientu zloženia mobilnej fázy na nízkotlakovej linke.

Mobilná fáza z nádob (1) cez vstupné filtre (9) a gradientový programátor (10) je privádzaná presným vysokotlakovým čerpadlom (2) do systému zavádzania vzorky (3) - ručný injektor alebo autosampler, kde sa vzorka vstrekuje. Ventily gradientového programátora sú riadené buď riadiacou jednotkou systému (čerpadlo alebo ovládač) alebo riadiacim programom PC. Systémy tohto typu tvoria binárne, trojrozmerné a štvorrozmerné gradienty. Forma funkcie spracovania gradientu závisí od konkrétneho riadiaceho modulu alebo riadiaceho programu, ako aj od funkčnosti riadeného a riadiaceho modulu. Potom cez in-line filter (8) vzorka s prúdom mobilnej fázy vstupuje do separačného prvku (prvkov) (4) - cez ochrannú kolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a je odstránený do prepadovej nádoby (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaznamená a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od konštrukcie funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (zvyčajne ovládač čerpadla alebo systému), alebo riadiacim programom z osobného počítača. V prípade ovládania riadiacej jednotky je možné detektor samostatne ovládať z vlastnej klávesnice.

Napriek zdanlivej atraktivite takýchto systémov (používajú iba jedno vysokotlakové presné čerpadlo) majú tieto systémy množstvo nevýhod, z ktorých hlavnou je snáď striktná potreba dôkladného odplynenia komponentov mobilnej fázy, dokonca aj pred nízkotlakový mixér (komora gradientového programátora). Vykonáva sa pomocou špeciálnych prietokových odplyňovačov. Vďaka tomu sa ich cena stáva porovnateľnou s iným typom gradientových systémov - systémami s tvorbou zloženia gradientu mobilnej fázy na vysokotlakovom potrubí.

Zásadným rozdielom medzi systémami s tvorbou zloženia gradientu mobilnej fázy na vysokotlakovom potrubí je miešanie zložiek vo vysokotlakovom potrubí, prirodzene pri tomto prístupe je počet presných čerpadiel určený počet nádrží na miešanie mobilnej fázy. Týmto prístupom sa výrazne znižujú požiadavky na dôkladnosť odplynenia komponentov.

Schéma gradientového chromatografu s tvorbou gradientu zloženia mobilnej fázy na vysokotlakovej čiare.

Mobilná fáza z nádob (1) cez vstupné filtre (9) je privádzaná vysokotlakovými presnými čerpadlami (2 a 11) cez statický alebo dynamický prietokový mixér (10) do systému zavádzania vzoriek (3) - ručný injektor alebo autosampler, kde sa vzorka vstrekuje. Prevádzka riadených čerpadiel je riadená buď riadiacou jednotkou systému („hlavné čerpadlo“ čerpadlo alebo ovládač) alebo riadiacim programom PC. V tomto prípade sú všetky čerpadlá riadené. Systémy tohto typu tvoria binárny alebo trojrozmerný gradient. Forma funkcie spracovania gradientu závisí od konkrétneho riadiaceho modulu alebo riadiaceho programu, ako aj od funkčnosti riadeného a riadiaceho modulu. Potom cez in-line filter (8) vzorka s prúdom mobilnej fázy vstupuje do separačného prvku (prvkov) (4) - cez ochrannú kolónu do separačnej kolóny. Potom eluát vstupuje do detektora (5) a je odstránený do prepadovej nádoby (7). Keď eluát preteká meracím obvodom detektora, chromatogram sa zaregistruje a údaje sa prenesú do analógového zapisovača (rekordéra) (6) alebo iného systému na zber a spracovanie chromatografických údajov (integrátor alebo počítač). V závislosti od vyhotovenia funkčných modulov je možné systém ovládať z klávesnice riadiaceho modulu (spravidla ovládač čerpadla alebo systému), alebo riadiacim programom z osobného počítača. V prípade ovládania riadiacej jednotky je možné detektor samostatne ovládať z vlastnej klávesnice.

Navrhované schémy sú dosť zjednodušené. Systémy môžu zahŕňať prídavné zariadenia - stĺpcový termostat, postkolónové derivatizačné systémy, systémy prípravy a koncentrácie vzoriek, recyklátor rozpúšťadiel, membránové systémy na potlačenie vodivosti pozadia (pre iónovú chromatografiu), prídavné ochranné systémy (filtre, kolóny) atď. V diagramoch nie sú moduly meradiel zobrazené samostatne. Spravidla sú tieto zariadenia zabudované do čerpacích jednotiek. Tieto jednotky môžu kombinovať viacero čerpadiel, čerpadlo s gradientovým programátorom a spoločný systémový ovládač. Štruktúra systému závisí od jeho konfigurácie a každého konkrétneho výrobcu.

Táto radikálna komplikácia technického zabezpečenia chromatografického procesu vedie k vzniku množstva požiadaviek na vlastnosti mobilnej fázy, ktoré v klasickej kolónovej a planárnej chromatografii chýbajú. Kvapalná fáza musí byť vhodná na detekciu (byť priehľadná v danej spektrálnej oblasti alebo mať nízky index lomu, určitú elektrickú vodivosť alebo dielektrickú konštantu a pod.), inertná k materiálom častí chromatografickej dráhy, netvorí plynové bubliny vo ventiloch čerpadla a detekčnej cele obsahujú mechanické nečistoty.

V kvapalinovej chromatografii používať veľa druhov čerpadiel. Pre nízkotlakové LC sa často používajú peristaltické čerpadlá (obr. 1).

Obr. 1 Programovateľné peristaltické čerpadlo MasterFlex.

Pri HPLC sa používajú vysokotlakové čerpadlá na zabezpečenie prietoku mobilnej fázy cez kolónu so špecifikovanými parametrami.

Najdôležitejšie technické charakteristiky čerpadiel HPLC sú: rozsah prietoku; maximálny pracovný tlak; reprodukovateľnosť toku; rozsah pulzácií prívodu rozpúšťadla.

Podľa povahy prívodu rozpúšťadla môžu mať čerpadlá konštantný prívod (prietok) a konštantný tlak. V zásade sa pri analytickej práci používa konštantný prietok pri plnení kolón - konštantný tlak.

Podľa princípu činnosti sú čerpadlá HPLC rozdelené na striekačka a ďalej piest recipročné .

Injekčné pumpy

Hlavným rozlišovacím znakom týchto čerpadiel je cyklickosť ich činnosti, v súvislosti s ktorou sa v cyklickej prevádzke líšia aj chromatografy, v ktorých sú tieto čerpadlá použité.

Ryža. 2. Základná konštrukcia injekčnej pumpy pre HPLC.

Ryža. 2A. Injekčná pumpa.

Riadiaca jednotka CU napája motor D napätím, ktoré určuje rýchlosť a smer jeho otáčania. Otáčanie motora pomocou prevodovky P sa premieňa na pohyb piestu P vo vnútri valca D. Čerpadlo pracuje v 2 cykloch. Počas cyklu plnenia je ventil K2 zatvorený, K1 otvorený, rozpúšťadlo je privádzané zo zásobníka do valca C. V režime zásobovania je ventil K1 zatvorený a cez ventil K2 vstupuje mobilná fáza do dávkovacieho zariadenia.

Čerpadlá tohto typu sa vyznačujú takmer úplnou absenciou pulzácií toku mobilnej fázy počas prevádzky.

Nevýhody čerpadla:

a) vysoká spotreba času a rozpúšťadla na preplachovanie pri výmene rozpúšťadla;

b) objem PF obmedzený objemom striekačky, a teda obmedzený čas separácie;

c) pozastavenie separácie počas plnenia čerpadla;

d) veľké rozmery a hmotnosť pri zabezpečení vysokého prietoku a tlaku (potrebujete silný motor a veľkú silu piestu pri jeho veľkej ploche).

Piestové piestové čerpadlá.

Ryža. 3. Základná konštrukcia piestového čerpadla.

Princíp fungovania.

Motor D cez prevodovku P poháňa piest P vratným pohybom, ktorý sa pohybuje v pracovnej hlave čerpadla. Ventily K1 a K2 sa otvárajú, keď je čerpadlo vo fáze nasávania a výtlaku. Objemový prietok je určený tromi parametrami: priemerom piestu (zvyčajne 3,13; 5,0; 7,0 mm), jeho amplitúdou (12-18 mm) a frekvenciou (ktorá závisí od rýchlosti otáčania motora a prevodovky).

Čerpadlá tohto typu zabezpečujú konštantný objemový prietok mobilnej fázy po dlhú dobu. Maximálny pracovný tlak je 300-500 atm, prietok 0,01-10 ml / min. Reprodukovateľnosť objemového krmiva -0,5%. Hlavnou nevýhodou je, že rozpúšťadlo je privádzané do systému vo forme série po sebe nasledujúcich impulzov, preto dochádza k pulzáciám tlaku a prietoku (obr. 4). To je hlavný dôvod zvýšeného šumu a zníženej citlivosti takmer všetkých detektorov používaných v LC, najmä elektrochemických.

Obr. Zvlnenie piestového čerpadla.

Spôsoby, ako sa vysporiadať s pulzáciami.

1. Aplikácia tlmiacich zariadení.

Ide o špirálové rúrky špeciálneho profilu vyrobené z nehrdzavejúcej ocele, zapojené sériovo alebo paralelne v systéme medzi čerpadlom a dávkovacou jednotkou.

Ryža. 5. Špirálový tlmič.

Tlmič sa roztočí, keď sa v ňom zvýši tlak (zrýchlenie zdvihu čerpadla). Pri poklese tlaku sa krúti, zmenšuje sa jeho objem, vytláča časť rozpúšťadla, pričom udržiava konštantný prietok a znižuje pulzácie. Takýto tlmič funguje dobre pri tlaku 50 atm a viac.

Pri tlaku 5-30 atm lepšie vyhladzuje pulzácie vzduchová klapka vyrobený zo stĺpika (obr. 6.). Vzduch v tlmenej kolóne (6x200 mm) je stlačený a pulzácie sú tlmené. Vzduch v ňom sa rozpustí za 24 hodín.

Ryža. 6. Vzduchová klapka.

2. Používanie elektronických zariadení.

Pri použití elektronického tlakového snímača sa môže údaj snímača použiť na riadenie prevádzky čerpadla. Keď tlak klesá, otáčky motora sa zvyšujú a kompenzujú pokles tlaku. Je tiež možné kompenzovať netesnosti vo ventiloch a čiastočne v manžetách. Použitie elektronického tlmiča (BPZh-80, KhPZh-1 atď.) Umožňuje znížiť tlakové pulzácie na 1 atm pri tlaku 100-150 kgf / cm2.

1.6.3. Iónová výmena, iónová, iónovo-párová chromatografia. Metódy iónovo-výmennej, iónovej a iónovo-párovej chromatografie sú založené na dynamickom procese nahrádzania iónov spojených so stacionárnou fázou iónmi eluentu vstupujúcich do kolóny. Hlavným cieľom chromatografického procesu je separácia anorganických alebo organických iónov rovnakého znamienka. Retencia pri týchto typoch chromatografie je určená zmenou voľnej energie iónomeničovej reakcie. Pomer koncentrácií vymenených iónov v roztoku a vo fáze sorbentu je charakterizovaný iónomeničovou rovnováhou. Iónová výmena spočíva v tom, že niektoré látky (iónomeniče), keď sú ponorené do roztoku elektrolytu, absorbujú z neho katióny alebo anióny, pričom do roztoku uvoľňujú ekvivalentné množstvo iných iónov s nábojom rovnakého znamienka. Výmena katiónov prebieha medzi meničom katiónov a roztokom a výmena aniónov medzi meničom aniónov a roztokom.

Katiónomeniče sú najčastejšie špeciálne syntetizované nerozpustné polymérne látky obsahujúce vo svojej štruktúre ionogénne kyslé skupiny: –SO 3 H; -COOH; -OH; -P03H2; -AsO3H2.

Chemické vzorce katexov možno schematicky znázorniť ako R-S03H; R - SO 3 Na. V prvom prípade je katex v H-forme, v druhom v Na-forme. R je polymérna matrica.

Katiónové výmenné reakcie sú napísané ako bežné heterogénne chemické reakcie:

RH + Na + RNa + H+

Aniónomeniče obsahujú vo svojej štruktúre základné ionogénne skupiny: –N (CH 3) 3 +; = NH2+; = NH + atď. Ich chemické vzorce môžu byť znázornené ako RNH3OH a RNH3Cl alebo ROH, RCl. V prvom prípade je aniónomenič v OH-forme, v druhom v Cl-forme. Reakciu výmeny aniónov možno zapísať takto:

R - OH + Cl - RCl + OH -

Známe amfotérne iónomeniče obsahujúce vo svojej štruktúre kyslé aj zásadité skupiny. Iónomeniče obsahujúce rovnaký typ (napríklad SO 3 H) kyslé (bázické) skupiny sa nazývajú monofunkčné; iónomeniče obsahujúce rôzne typy (napríklad SO 3 H, OH) kyslé (bázické) polyfunkčné skupiny.

Monofunkčné iónomeniče sa vyrábajú polymerizačnou reakciou. Polykondenzačná reakcia umožňuje získať polyfunkčné iónomeniče. Aby výsledné iónomeniče mali dostatočne vysoké prevádzkové vlastnosti, musia byť nerozpustné, ale musia napučať vo vhodnom rozpúšťadle a musia mať dostatočné veľké množstvo ionogénne skupiny schopné výmeny s ionogénnymi skupinami analyzovanej vzorky. To sa dá dosiahnuť, ak sú výsledné polymérne reťazce dostatočne rozvetvené a navzájom spojené "zosieťovacími mostíkmi". Napríklad pri výrobe katexov polymerizačného typu na báze styrénu sa ako sieťovadlo najčastejšie používa divinylbenzén, ktorého zavedenie v množstve do 16 % zabezpečuje výrobu iónomeničov s rôznym stupňom napučiavania resp. , teda umožňuje regulovať pórovitosť iónomeniča. Stupeň napučania iónomeniča, vyjadrený v mililitroch/gram, je objem 1 g vzduchom vysušeného iónomeniča naplneného v kolóne.

Iónomenič spravidla absorbuje jeden z protiiónov iónov v mobilnej fáze, t.j. vykazuje určitú selektivitu. Experimentálne sa stanovila séria afinity alebo selektivity iónov vo vzťahu k iónomeničom odlišné typy... Napríklad pri nízkych koncentráciách roztoku na silne kyslých katexoch sa ióny s rovnakým nábojom sorbujú v nasledujúcom poradí:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+.

Pre ióny s rôznym nábojom sa sorpčná kapacita zvyšuje so zvyšujúcim sa nábojom:

Na + Ca 2+

Zmena podmienok na uskutočnenie iónomeničovej reakcie však môže viesť k obráteniu série. Hodnoty afinity boli tiež stanovené pre anexy. Napríklad sorpčná kapacita aniónov na silne zásaditých anexoch sa zvyšuje v nasledujúcom poradí:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 -.

Iónomeniče obsahujúce vo svojej štruktúre silne kyslé alebo silne zásadité skupiny vstupujú do iónomeničových reakcií s akýmikoľvek iónmi v roztoku, ktoré majú náboje rovnakého znamienka ako protiión. Takéto iónomeniče sa nazývajú univerzálne.

Proces iónovej výmeny medzi analytom a iónomeničom sa môže uskutočniť jedným z troch spôsobov: statickým, dynamickým (metóda iónomeničového filtra) a chromatografiou.

Statická metóda iónová výmena spočíva v tom, že vzorka iónomeniča sa privedie do kontaktu s určitým objemom roztoku a určitý čas sa mieša alebo pretrepáva, kým sa nenastolí rovnováha. Ide o rýchlu a jednoduchú metódu iónovej výmeny, ktorá sa používa na koncentráciu iónov zo zriedených roztokov, odstránenie nepotrebných nečistôt, ale nezabezpečuje úplnú absorpciu iónov, pretože iónová výmena je nerovnovážny proces, a preto nezaručuje úplné oddelenie. iónov.

Pri vykonávaní výmeny iónov dynamickým spôsobom cez kolónu s iónomeničom prechádza roztok, ktorý sa pri pohybe po kolóne dostáva do kontaktu s novými granulami iónomeniča. Tento proces poskytuje úplnejšiu výmenu ako statická metóda, pretože produkty výmeny sú odstránené prúdom roztoku. Dokážu koncentrovať ióny zo zriedených roztokov a oddeľovať ióny, ktoré sa značne líšia svojimi vlastnosťami, napríklad ióny rôzneho náboja (oddelené katióny od aniónov), ale oddelenie iónov s rovnakým nábojovým znakom je prakticky nemožné. Kvantitatívna separácia takýchto iónov je možná len pri opakovanom opakovaní sorpčno-desorpčných elementárnych aktov za dynamických podmienok, t.j. chromatografická metóda ... Pri práci s touto metódou sa používajú vysoké vrstvy iónomeniča a do tejto vrstvy sa zavádza separovaná zmes v množstve oveľa menšom, ako je kapacita kolóny, čím je zabezpečené viacnásobné opakovanie elementárnych úkonov iónovej výmeny. .

Pokiaľ ide o techniku analýzy, iónomeničová chromatografia je podobná molekulárnej chromatografii a môže sa vykonávať podľa eluentu (vyvíjacieho), frontálneho a vytesňovacieho variantu. Rozdiel medzi molekulárnou a iónomeničovou chromatografiou je v tom, že pri molekulárnej chromatografii sa oddelené zložky zmesi vymývajú z kolóny čistým eluentom a pri iónovej výmene sa ako eluent používa roztok elektrolytu. V tomto prípade by sa vymenený ión eluentu mal sorbovať menej selektívne ako ktorýkoľvek z iónov zmesi, ktorá sa má oddeliť.

Pri vykonávaní vyvolávacej iónomeničovej chromatografie, ktorá sa najčastejšie používa, sa kolóna naplnená iónomeničom najskôr premýva roztokom elektrolytu, kým iónomenič úplne nenahradí všetky svoje ióny iónmi obsiahnutými v eluente. Potom sa do kolóny zavedie malý objem roztoku analytu, ktorý obsahuje oddelené ióny v množstve asi 1 % kapacity iónomeniča. Potom sa kolóna premyje roztokom elučného činidla, pričom sa odoberú frakcie eluátu a analyzujú sa.

Zmes iónov Cl -, Br -, J - je možné separovať na vysoko zásaditom aniónomeniči (zosieťovaný polystyrén obsahujúci skupiny kvartérnych amóniových báz N (CH 3) 3 +), napr. AB-17, ktorý má rad selektivity (selektivity): NO 3 - Cl - Br - J -. V dôsledku toho sa ako eluent použije roztok NaN03. Najprv tento roztok prechádza cez iónomenič, kým nie je úplne nasýtený iónmi NO 3 -. Keď sa zmes, ktorá sa má separovať, zavedie do kolóny, ióny Cl-, Br-, J- sú absorbované meničom aniónov, čím sa vytlačia ióny N03-. Pri následnom premývaní kolóny roztokom NaNO 3 sú ióny Cl -, Br -, J - v horných vrstvách aniónomeniča postupne nahradené iónmi NO 3 -. Cl - ióny budú vytesnené najrýchlejšie, J - ióny zostanú v stĺpci najdlhšie. Rozdiel v selektivite iónomeniča k iónom zmesi vedie k vytvoreniu oddelených zón adsorbovaných Cl-, Br- a J- iónov v kolóne, pohybujúcich sa pozdĺž kolóny rôznymi rýchlosťami. Ako sa pohybujete v stĺpci, vzdialenosť medzi zónami sa zväčšuje. Každá zóna obsahuje len jeden z aniónov zmesi, ktorá sa má oddeliť a anión eluentu, v intervale medzi zónami je len anión eluentu. Frakcie obsahujúce jednotlivé zložky zmesi, ktorá sa má separovať, sa teda objavia v eluente na výstupe z kolóny.

Pre riešenie praktických problémov sa podmienky separácie iónov menia výberom vhodnej mobilnej fázy (zloženie, koncentrácia, pH, iónová sila) alebo zmenou pórovitosti polymérnej matrice iónomeniča, tj počtu medzireťazcových väzieb v matricu a vytváranie iónomeničových sít, ktoré sú priepustné pre niektoré ióny a schopné ich výmeny a nepriepustné pre iné. Je tiež možné zmeniť povahu a vzájomné usporiadanie ionogénnych skupín, ako aj získať sorbenty schopné selektívnych chemických reakcií v dôsledku tvorby komplexov. Vysokú selektivitu vykazujú napríklad komplexotvorné iónomeniče obsahujúce vo svojej štruktúre chelatačné skupiny organických činidiel dimetylglyoxím, ditizón, 8-hydroxychinolín atď., ako aj korunové étery.

Najväčšie uplatnenie v iónovo-výmennej, iónovej a iónovo-párovej chromatografii nachádzajú syntetické makro- a mikroretikulárne organické iónomeniče s vysokou výmennou kapacitou (3–7 mmol/g), ako aj anorganické iónomeničové materiály. Mikroretikulárne iónomeniče sú schopné iónovej výmeny iba v napučanom stave, makroretikulárne - v napučanom a nenapučanom stave. Ďalším konštrukčným typom iónomeničov sú povrchovo-vrstvové iónomeniče, ktorých pevné jadro je vyrobené z neporézneho kopolyméru styrénu a divinylbenzénu, skla alebo silikagélu a je obklopené tenkým filmom iónomeniča. Celkový priemer takejto častice je asi 40 mikrónov, hrúbka filmu iónomeniča je 1 mikrón. Nevýhodou takýchto iónomeničov je relatívne veľký priemer častíc a nízka výmenná kapacita v dôsledku nízkeho špecifického povrchu, v dôsledku čoho je potrebné pracovať s malými vzorkami, a teda používať vysoko citlivé detektory. Okrem toho sú takéto iónomeniče pomerne rýchlo otrávené a nie sú schopné regenerácie.

Vysokoúčinná iónomeničová a iónová chromatografia využíva objemové porézne polystyrénové iónomeniče, objemové porézne siliky s priemerom granúl cca 10 μm, ako aj prakticky nenapučiavajúce povrchovo porézne a povrchovo modifikované kopolyméry styrénu a divinylbenzénu s iónovými sulfo- a aminoskupiny.

Pri iónovo-párovej chromatografii sa používajú "kefkové" sorbenty - silikagély s naočkovanými reverznými fázami C 2, C 8, C 18, ktoré sa po absorpcii iónových tenzidov z mobilnej fázy ľahko premieňajú na katexové tenzidy, napr. sírany alebo soli kvartérnych amóniových zásad.

Pri chromatografickej separácii na iónomeničoch sa ako mobilná fáza najčastejšie používajú vodné roztoky solí. Je to spôsobené tým, že voda má vynikajúce rozpúšťacie a ionizačné vlastnosti, vďaka ktorým sa molekuly analyzovanej vzorky okamžite disociujú na ióny, iónomeničové skupiny iónomeniča sú hydratované a tiež prechádzajú do úplne alebo čiastočne disociovanej formy. . To zaisťuje rýchlu výmenu protiiónov. Elučnú silu mobilnej fázy ovplyvňuje najmä pH, iónová sila, povaha tlmivého roztoku a obsah organického rozpúšťadla alebo povrchovo aktívnej látky (iónová párová chromatografia).

Hodnota pH sa volí v závislosti od povahy iónových skupín, oddelených iónov a matrice. So silne kyslými a silne zásaditými iónomeničmi je možné pracovať pri pH = 2–12, so slabo kyslými pri pH = 5–12, so slabo zásaditými pri pH = 2–6. Sorbenty na báze oxidu kremičitého s pH 9 nemožno použiť. Iónová sila mobilnej fázy ovplyvňuje kapacitu iónomeniča. So zvyšujúcou sa iónovou silou sa sorpcia iónov zvyčajne znižuje, pretože sa zvyšuje elučná sila mobilnej fázy. Na začiatku separácie by preto mala mať mobilná fáza nízku iónovú silu (0,05–0,1) a výsledná hodnota tejto charakteristiky by nemala presiahnuť 2. Pri gradientovej elúcii sa často používajú tlmivé roztoky so zvyšujúcou sa iónovou silou.

Na selektívnu elúciu iónov absorbovaných iónomeničom možno použiť vodu, tlmiace roztoky (fosfát, acetát, boritan, hydrouhličitan atď.) s určitou hodnotou pH a iónovou silou, roztoky minerálov (soľ, dusík, sírová, fosforečná ) a organické (fenol, citrónová, mliečna, vínna, šťaveľová, EDTA) kyseliny. Výber eluentu uľahčuje skutočnosť, že limitné distribučné koeficienty väčšiny prvkov medzi vodnými (vodno-organickými) roztokmi mnohých komplexantov a iónomeničmi štandardného typu sú stanovené a uvedené v tabuľkách.

1.6.4. Veľkostne vylučovacia chromatografia. Veľkostná vylučovacia chromatografia je typ kvapalinovej chromatografie, pri ktorej je separácia zložiek založená na distribúcii molekúl v súlade s ich veľkosťou medzi rozpúšťadlom v póroch sorbentu a rozpúšťadlom prúdiacim medzi jeho časticami. Počas separačného procesu malé molekuly vstupujú do polymérnej siete, v ktorej póroch slúži rozpúšťadlo ako stacionárna fáza, a tam sa udržujú. Veľké molekuly nedokážu preniknúť do polymérnej siete a mobilnou fázou sa z kolóny vymyjú. Najprv sa eluujú najväčšie molekuly, potom médium a nakoniec najmenšie molekuly.

Vylučovacia chromatografia je rozdelená na gélovú permeáciu a gélovú filtráciu. Pri gélovej permeačnej chromatografii dochádza k separácii na polyméroch, ktoré napučiavajú v organických rozpúšťadlách. Verzia vylučovacej chromatografie s gélovou filtráciou zahŕňa použitie vo vode napučiavajúcich polymérov ako stacionárnych fáz.

Doba zotrvania zložiek analyzovanej vzorky v vylučovacej kolóne závisí od veľkosti ich molekúl a difúzie do pórov sorbentu, ako aj od veľkosti pórov stacionárnej fázy.

Pri tomto type kvapalinovej chromatografie je distribučný koeficient D pre najmenšie molekuly analyzovanej vzorky, ktoré sa v chromatografickej kolóne pohybujú najnižšou rýchlosťou, prenikajúce mriežkou stacionárnej fázy, sa rovná 1, pretože mobilná fáza a rozpúšťadlo v póroch stacionárnej fázy majú rovnaké zloženie. V tomto prípade má základná rovnica stĺpcovej chromatografie tvar

Veľké molekuly, ktoré nevstupujú do pórov stacionárnej fázy, sú z kolóny eluované spolu s mobilnou fázou. Pre nich D= 0, a V R =V m... Tento rozsah hodnôt distribučného koeficientu (od 0 do 1) je charakteristický len pre vylučovaciu chromatografiu.

Všetky molekuly analyzovanej viaczložkovej látky by sa mali z kolóny vymyť pri prechode malého objemu rozpúšťadla V m predtým V m +V s a separácia končí skôr, ako sa objaví pík rozpúšťadla. Preto je pri tomto type chromatografie potrebné použiť dostatočne dlhé kolóny s veľkým voľným objemom. V m a veľké množstvo pórov v sorbente.

Rozlíšenie chromatografických píkov pri separácii podľa veľkosti sa môže zlepšiť použitím gradientovej elúcie so zmiešanými rozpúšťadlami.

Každý sorbent používaný pri vylučovacej chromatografii je charakterizovaný určitým objemom pórov, a preto má určitý rozsah oddelených molekulových hmotností a určitú kalibračnú krivku. V tomto prípade má kalibračný graf, ktorý charakterizuje závislosť retenčného objemu od molekulovej hmotnosti alebo veľkosti molekúl, spravidla komplexný tvar.

Stacionárne fázy pri vylučovacej chromatografii sa vyberajú na základe špecifických analytických úloh. Najprv sa stanoví, ktorý systém rozpúšťadiel možno použiť na analýzu (vodný alebo vodno-organický). V závislosti od toho sa určuje typ sorbentu. Ak je potrebné separovať vo vode rozpustné vzorky, používajú sa ako stacionárne fázy napríklad vodou napučiavajúce zosieťované dextrány (Sephadexes) alebo polyakrylamidy (Biogel R). Separáciu látok rozpustných v organických rozpúšťadlách je možné realizovať na polystyrénoch s rôznym stupňom zosieťovania, napučiavania v organických rozpúšťadlách (styrogel, poragel, biobid C). Takéto napučané gély sú všeobecne nestabilné voči tlaku a umožňujú veľmi nízke prietoky mobilnej fázy, čo predlžuje čas analýzy. Na realizáciu vysoko účinnej verzie vylučovacej chromatografie je potrebné použiť stacionárne fázy s pevnými matricami silikagélov, ktorých nevýhoda vysoká adsorpčná aktivita - je eliminovaná silanizáciou povrchu alebo výberom eluentu zodpovedajúceho polarite.

Látky, ktoré možno použiť ako mobilné fázy pri vylučovacej chromatografii:

 úplne rozpustiť analyzovanú vzorku;

 dobre navlhčite sorbent;

 pôsobiť proti adsorpcii zložiek vzorky na sorbente;

 majú nízku viskozitu a toxicitu.

1.6.5. Rovinná chromatografia... Rovinná chromatografia zahŕňa tenkovrstvovú a papierovú chromatografiu. Tieto typy kvapalinovej chromatografie sú z hľadiska vykonávania jednoduché, expresné, nevyžadujú drahé vybavenie, čo je ich nespornou výhodou.

Separáciu zmesi látok týmito metódami je možné uskutočniť pomocou rôznych chromatografických systémov. Preto existuje adsorpcia, distribúcia, normálna a reverzná fáza, iónová výmena atď. papierová a tenkovrstvová chromatografia. Chromatografia na tenkej vrstve je v súčasnosti najpoužívanejšou metódou.

Papierová a tenkovrstvová chromatografia sú v technike podobné. Papierové celulózové vlákno sa používa ako stacionárna fáza v papierovej chromatografii, pri tenkovrstvovej chromatografii sa rôzne sorbenty (Al 2 O 3, silikagél a pod.) nanášajú v rovnomernej tenkej (100 - 300 μm) vrstve na sklo, kovový alebo plastový substrát (nosič) ... Vrstva adsorbenta na nosiči môže alebo nemusí byť fixovaná.

Chromatografická separácia v rovinných metódach, ako v kolóne, je spôsobená prenosom zložiek analytu mobilnou fázou pozdĺž vrstvy stacionárnej fázy rôznymi rýchlosťami v súlade s distribučnými koeficientmi látok, ktoré sa majú separovať. V oboch prípadoch sa používajú chromatografické systémy kvapalina-tuhý sorbent (adsorbčný separačný mechanizmus), kvapalina-kvapalina-tuhý nosič (distribúcia, iónomenič a iné mechanizmy).

Ako mobilné fázy sa používajú rôzne rozpúšťadlá alebo ich zmesi, organické alebo anorganické kyseliny.

Praktické získanie planárnych chromatogramov je nasledovné.

Na prúžku chromatografického papiera alebo na tenkej vrstve sorbentu vyznačte ceruzkou štartovaciu čiaru vo vzdialenosti 1 cm od spodného okraja prúžku alebo platne. Pomocou mikropipety naneste vzorku na štartovaciu čiaru vo forme škvrny s priemerom maximálne 2 - 3 mm. Potom sa okraj pásu alebo dosky spustí do nádoby s mobilnou fázou umiestnenou v utesnenej komore. Pri stúpaní mobilnej fázy pozdĺž pásika alebo platne a výskyte viacerých elementárnych aktov sorpcie-desorpcie, distribúcie medzi dve kvapalné fázy, iónovej výmeny atď., obvyklých v chromatografii, dochádza k separácii zložiek analyzovanej zmesi. Proces zvyčajne pokračuje, kým rozpúšťadlo neprejde z 10 cm štartovacej čiary. Potom sa pás alebo platňa vyberie z komory a vysuší. Ak sú zložky analytu sfarbené, vytvárajú na chromatograme zodpovedajúce farebné škvrny. Chromatogram sa musí vyvinúť na detekciu nesfarbených zložiek analytu. Vyvolanie chromatogramu a detekcia zložiek vzorky sa môže uskutočniť rôznymi metódami a závisí od zloženia analyzovaných zmesí. Manifestácia sa môže uskutočniť:

 pomocou UV osvetlenia. Metóda je použiteľná na detekciu látok schopných emitovať vlastné žiarenie (luminiscenčné) v rozsahu viditeľných vlnových dĺžok pod vplyvom UV žiarenia;

 pomocou vývojových činidiel. Napríklad prítomnosť aminokyselín v analyzovanej zmesi možno detegovať pomocou ninhydrínu. Vysušený chromatogram sa ponorí do 0,2 % roztoku ninhydrínu v acetóne a potom sa vysuší. Škvrny zodpovedajúce rôznym zložkám zmesi získajú vizuálnu a spravidla farbu špecifickú pre každú látku;

 pomocou jódu. V tomto prípade sa detegovaný chromatogram vloží do nádoby s kryštálmi jódu na dne. Jódové výpary sú na škvrnách silnejšie adsorbované, vďaka čomu sú škvrny vizualizované. Jód je nešpecifické vývojové činidlo. Pomocou špecifických činidiel je možné nielen určiť množstvo zložiek zmesi, ale aj identifikovať oddelené látky podľa farby škvŕn.

Papierová chromatografia a chromatografia na tenkej vrstve sa najčastejšie uskutočňujú v takzvanej forme zdola nahor opísanej vyššie. Pomerne často je na zlepšenie kvality chromatogramov potrebné použiť zložitejšie varianty rovinnej chromatografie, napríklad zhora nadol, kruhovú, dvojrozmernú. Pri papierovej chromatografii zhora nadol alebo pri chromatografii na tenkej vrstve sa analyt nanáša na štartovaciu čiaru platne alebo papierového prúžku navrchu a eluent sa privádza zhora a nie zdola. Pozitívny efekt zlepšenia separácie je spôsobený príspevkom gravitácie k separačnému procesu.

Vzostupná aj zostupná chromatografia sa môže uskutočňovať v jednorozmernom a dvojrozmernom variante. Na rozdiel od vyššie opísaného procesu jednorozmernej separácie v plochej vrstve pri dvojrozmernej chromatografickej separácii sa separácia analyzovanej vzorky najskôr uskutoční v jednom rozpúšťadle, potom sa separácia uskutoční v smere kolmom na prvé rozpúšťadlo. s použitím iného rozpúšťadla, otočením prvého chromatogramu o 90 °C.

Pri kruhovej chromatografii sa analyt aplikuje ako kvapka do stredu platne alebo hárku chromatografického papiera. Po kvapkách sa sem privádza aj jedno alebo viac rozpúšťadiel. Výsledkom je, že výsledný chromatogram je súborom radiálnych škvŕn.

Poloha škvŕn (zón), ktoré tvoria oddelené zložky analytu na plochom chromatograme, je charakterizovaná hodnotami relatívnej rýchlosti pohybu zložiek v tenkej vrstve. R fi... Experimentálne množstvo R fi definovaný ako pomer vzdialenosti L i prešiel i-tá zložka, do diaľky L prejdené rozpúšťadlom od štartovacej čiary k prednej línii (obrázok 1.10):

Množstvo R fi závisí od charakteru zodpovedajúcej zložky analyzovanej vzorky, charakteru stacionárnej fázy, jej hrúbky, charakteru a kvality mobilnej fázy, spôsobu aplikácie vzorky a ďalších faktorov, ale vždy R fi 1.

Množstvo R fi je v skutočnosti identický s retenčným časom látky alebo jej retenčným objemom, ktorý charakterizuje rýchlosť prechodu látky cez chromatografickú kolónu a môže byť použitý na kvalitatívnu identifikáciu zložiek analyzovanej vzorky a priemer škvrny je identický do výšky alebo plochy chromatografického píku, a preto do určitej miery odráža kvantitatívny obsah látky.

Kvantitatívne určenie zloženia analyzovanej vzorky možno v najjednoduchšom prípade posúdiť vizuálne podľa intenzity vnútornej farby škvŕn alebo intenzity fluorescenčnej žiary získaných škvŕn počas UV detekcie. Na tieto účely sa široko používa chromatografická bodová elúcia. V tomto prípade sa škvrna získaná na chromatograme opatrne vyreže alebo zoškrabe, ošetrí sa vhodným rozpúšťadlom a výsledný roztok sa preskúma vhodnou fyzikálno-chemickou metódou. Je možné použiť aj gravimetrickú metódu, pri ktorej sa z chromatogramu vyreže a odváži zodpovedajúca škvrna. Množstvo látky je určené rozdielom medzi hmotnosťou čistého papiera rovnakej plochy a papiera s látkou.

Papier (BH ) a chromatografia na tenkej vrstve (TLC ) separačným mechanizmom pozri deliaca chromatografia ... Pri BH metóde je nosič špeciálny chromatografický papier s určitými vlastnosťami. Stacionárna fáza slúži ako voda adsorbovaná na povrchu a póroch papiera (do 20%), mobilné  organické rozpúšťadlo, miešateľné alebo nemiešateľné s vodou, vodou alebo roztokmi elektrolytov.

Mechanizmus na papieri dosť komplikované. V stacionárnej fáze môže byť látka zadržaná nielen v dôsledku rozpustenia vo vode adsorbovanej papierom, ale aj adsorbovať priamo s celulózou. Vytlačené na papieri zdieľané komponenty prechádzajú do mobilnej fázy a papierové kapiláry sa pohybujú rôznymi rýchlosťami v súlade s koeficient medzifázového rozdelenia každý z nich. Na začiatku chromatografia časť hmoty z papiera ide do mobilná fáza a ísť ďalej. Keď organické rozpúšťadlo dosiahne oblasť papiera bez rozpustených látok, objaví sa to znova prerozdeľovanie : z organickej fázy látka prechádza do vodnej, sorbovaná na papieri. Keďže komponenty majú rôzne afinita k sorbentu , keď sa eluent pohybuje, dochádza k separácii: niektoré látky sú oneskorené na začiatku cesty, iné sa pohybujú ďalej. Tu sú kombinované termodynamické (ustanovenie rovnovážneho rozdelenia látok medzi fázami) a kinetická (pohyb komponentov rôznou rýchlosťou) aspekty separácie. Výsledkom je, že každá zložka je sústredená na konkrétnu oblasť listu papiera: oblasti jednotlivých komponentov na chromatogram ... Použitie chromatografie na papieri má množstvo podstatných nevýhod: závislosť separačného procesu od zloženia a vlastností papiera, zmena obsahu vody v póroch papiera pri zmene podmienok skladovania, veľmi nízka rýchlosť chromatografie (až niekoľko dní) a nízka reprodukovateľnosť výsledkov. Tieto nevýhody vážne ovplyvňujú rozšírenie papierovej chromatografie ako chromatografickej metódy.

V TLC metóda separačný proces zmesi látok prebieha v tenkej vrstve sorbent nanáša sa na inertný pevný podklad a zabezpečuje sa pohybom mobilná fáza (rozpúšťadlo) cez sorbent pri pôsobení kapilárne sily . Autor:separačný mechanizmus rozlišovať distribúcia, adsorpcia a iónomeničová chromatografia ... K oddeľovaniu zložiek v týchto prípadoch dochádza buď v dôsledku ich rozdielneho distribučného koeficientu medzi dvoma kvapalnými fázami ( deliaca chromatografia ), alebo v dôsledku rozdielnej adsorbovateľnosti zlúčenín sorbentom ( adsorpčná chromatografia ). Adsorpčná metóda je založená na rôznych stupňoch sorpcie-desorpcie separovaných zložiek na stacionárnej fáze. Adsorpcia vykonávané na náklady van der Waalsove sily čo je základ fyzikálna adsorpcia , polymolekulárne (tvorba niekoľkých vrstiev adsorbátu na povrchu adsorbentu) a chemisorpcia (chemická interakcia adsorbentu a adsorbátu).

V prípade použitia takých sorbentov pre TLC ako je napr oxid hlinitý alebo silikagél v divízii zohrávajú úlohu ako distribúcia a adsorpcia na vyvinutom aktívnom povrchu sorbentu (150 - 750 m2 / g). Distribúcia zložky zmesi sa vyskytujú medzi vodou na povrchu nosiča (napr adsorbenty , ako oxid hlinitý , škrob , celulóza , kremelina - a voda formulár stacionárna fáza ) a rozpúšťadlo pohybujúce sa cez túto stacionárnu fázu ( mobilná fáza ). Zložka zmesi, ktorá je rozpustnejšia vo vode, sa pohybuje pomalšie ako tá, ktorá je ľahšie rozpustná v mobilnej fáze.

Adsorpcia sa prejavuje v tom, že medzi nosič napríklad oxid hlinitý a zložky zmesi sú nastavené adsorpčné rovnováhy - pre každú zložku svoj vlastný, výsledkom čoho je rozdielna rýchlosť pohybu zložky zmesi. Možno rozlíšiť dva extrémne prípady:

a) koncentrácia látky na adsorbente je nulová. Látka sa úplne rozpustí v mobilnej fáze a je ňou odnášaná (pohybuje sa spolu s rozpúšťadlové čelo ).

b) látka je úplne adsorbovaná, neinteraguje s rozpúšťadlom a zostáva na začiatku.

V praxi so zručným výberom rozpúšťadla a adsorbenta distribúcia spojenia sa nachádzajú medzi týmito extrémnymi prípadmi a látka postupne prenesené z jednej vrstvy sorbentu do druhej v dôsledku simultánnych procesov sorpcia a desorpcia .

Rozpúšťadlo prechádzajúce cez sorbent je tzv eluent , proces pohybu látky spolu s eluentom  elúcia . Pri pohybe kvapaliny po platni dochádza pôsobením síl k oddeľovaniu zmesi látok adsorpcia , distribúcia , iónová výmena alebo kombináciou pôsobenia všetkých vyššie uvedených faktorov. V dôsledku toho oddelené chromatografické zóny zložky zmesi, t.j. ukázalo sa chromatogram .

Správny výber sorbent a eluent určuje separačnú účinnosť zmesi. Mobilita testovanej látky závisí od jej afinity k sorbentu a elučná sila (polarita) eluentu. So zvyšujúcou sa polaritou zlúčeniny sa zvyšuje aj jej afinita k polárnemu sorbentu. Zvyšovaním stupňa adsorpcie silikagél organické zlúčeniny sú usporiadané v rade: uhľovodíky<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь pre silikagél eluenty môžu byť usporiadané vo vzostupnom poradí "polarity" ( elučná schopnosť ) a tvoria sériu rozpúšťadiel ( eluotropný rad ) v súlade s experimentálnymi údajmi: alkány> benzén> chloroform> dietyléter> etylacetát> alkoholy C2-C4> voda> acetón> kyselina octová> metanol. Polárna zlúčenina, alkohol, je teda dosť silne adsorbovaná na silikagéli, a preto sa pri pôsobení takého nepolárneho rozpúšťadla, akým je hexán, pohybuje slabo a zostáva blízko štartovacej čiary. Nepolárny aromatický uhľovodík bifenyl je zase výrazne mobilnejší v hexáne, ale aj tu je možné dosiahnuť R f asi 0,5, je potrebný polárnejší aprotický eluent, metylénchlorid. Elučná sila regulovať pomocou zmesi rozpúšťadiel - susedov eluotropný rad s rôznou polaritou.

V súčasnosti sa v TLC používajú najmä nasledujúce. sorbenty : oddeliť lipofilné látky  silikagél , oxid hlinitý , acetylovaná celulóza , polyamidy ; zdielať hydrofilné látky  celulóza , celulózové iónomeniče , kremelina , polyamidy ... Najdôležitejšou charakteristikou sorbentu je jeho činnosť , t.j. schopnosť sorb (podržať) zložky zmesi, ktoré sa majú oddeliť. V zahraničí vyrába množstvo firiem silikagél , kremelina a oxid hlinitý s prídavkom 5% sadry, ktorá sa používa na fixáciu vrstvy sorbentu pri samovýrobe platní.

Najbežnejším sorbentom je silikagél - hydratovaná kyselina kremičitá, vzniká pôsobením minerálnych kyselín na Na 2 SiO 3 a vysušením vzniknutého solu. Po zomletí sólu sa použije frakcia určitej zrnitosti (uvedená na tanieri, zvyčajne 5-20 μm). Silikagél je polárny sorbent so skupinami ОН ako aktívnymi centrami. Ľahko sorbuje vodu na povrchu a vytvára vodíkové väzby.

Alumina je slabo zásaditý adsorbent a používa sa najmä na separáciu zlúčenín slabo zásaditého a neutrálneho charakteru. Nevýhodou platní na oxide hlinitom je povinná aktivácia povrchu pred použitím v sušiarni pri vysokej teplote (100 - 150 °C) a nízka, v porovnaní so silikagélom, adsorpčná kapacita vrstvy.

kremelina  adsorbent získaný z prírodných minerálov  kremelina. Sorbent má v porovnaní so silikagélom hydrofilné vlastnosti a nižšiu adsorpčnú kapacitu vrstvy.

Celulóza: tenkovrstvové platne potiahnuté celulózou sú veľmi účinné na separáciu zložitých organických molekúl. Adsorbentom sú najmä celulózové guľôčky s priemerom do 50 mikrónov, upevnené na nosiči so škrobom. Rovnako ako pri papierovej chromatografii je vzostup čela rozpúšťadla veľmi pomalý.

Chromatografická analýza sa vykonáva na priemyselných plechoch českej výroby“ Silufol » (« Silufol ") Vyrobené z hliníkovej fólie, niekedy vystuženej lepenkou a" Siluplast »Vyrobené z plastu potiahnutého vrstvou sorbentov - silikagél LS 5-40 so škrobom alebo sadrou ako spojivom (do 10%), alebo oxid hlinitý s fluorescenčnými indikátormi aj bez nich. taniere" Silufol »Majú vysokú rýchlosť elúcie, ale zároveň sa vyznačujú nízkou separačnou silou a nízkou citlivosťou. Pri skladovaní sú citlivé na podmienky (vlhkosť, teplota, agresívne prostredie a pod.). Dodávajú jednotlivé firmy chromatografické platne s vrstvou sorbentu rôznej (zvyčajne do 0,25 mm), ale prísne konštantnej hrúbky (silikagél, celulóza, iónomeničová živica), na skle a substrátoch z hliníkovej fólie, plastu, impregnovaného skleneného vlákna.

taniere" Sorbfil "(TU 26-11-17-89) sa vyrábajú v Rusku na polymérnej báze (polyetyléntereftalát, trieda P) alebo na hliníkovom substráte (trieda AF) s nanesenou pracovnou vrstvou mikrofrakcionovaný silikagélový sorbent triedy STKH-1A a STKH-1VE (vyrábané v ZSSR ako frakcionovaný silikagél KSKG) s hrúbkou 90-120 mikrónov (do 200 mikrónov), fixované špeciálnym spojivom - kremičitan ... Keď sa ako spojivo použije silikagél (silica sol), ktorý sa po zahriatí premení na silikagél, výsledné TLC platne pozostávajú z dvoch zložiek: vrstvy silikagélu a substrátu. Rovnomernosť hrúbky vrstvy sorbentu na jednej platni je ± 5 mikrónov. Príklad označenia: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UV (10x10)" - vysokovýkonné TLC platne na hliníkovom substráte, s fosforom, 10x10 cm.

Ak sa použije sklenený substrát (trieda C), potom sú takéto platne opakovane použiteľné a chemicky odolné. Ich chemická odolnosť je určená chemickou odolnosťou silikagélu. Výsledkom je, že TLC platne môžu byť opakovane ošetrené agresívnymi činidlami, napríklad horúcou zmesou chrómu, čo odstraňuje obmedzenia týkajúce sa použitia korelujúcich činidiel na detekciu škvŕn a modifikáciu sorbentov a umožňuje viacnásobnú (až 30-krát alebo viac) regeneráciu platní so zmesou chrómu. Sklenené dosky je možné rezať na požadovanú veľkosť. Mechanickú pevnosť vrstvy sorbentu je možné regulovať, čo na jednej strane poskytuje transport a opakované spracovanie dosiek a na druhej strane možnosť extrakcie adsorbčných vrstiev s oddelenými látkami pre následné vymývanie jednotlivých zlúčenín z sorbentu a ich ďalšie štúdium inštrumentálnymi metódami (IR a UV spektrometria, röntgenové štruktúrne metódy, NMR atď.).

Doštičky sa líšia veľkosťou frakcií (distribúciou častíc) silikagélu, z ktorého je vrstva zložená. Na analytických platniach (trieda A) je frakcia 5-17 mikrónov, na vysokovýkonných (trieda B) - 8-12 mikrónov. Užšie rozdelenie zvyšuje účinnosť vložiek, t.j. škvrny látok, ktoré sa majú oddeliť, sa stanú kompaktnejšími (menšou veľkosťou), a preto sa lepšie oddelia, keď čelo eluentu prechádza na kratšiu vzdialenosť. Na ruských platniach sa analytické a vysokovýkonné vrstvy veľmi nelíšia, na rozdiel od platní od spoločnosti Merck (Nemecko). Ak látky nie sú oddelené na testovacích platniach, použite vysokovýkonné platne. Doštičky všetkých modifikácií sú vyrábané s fosforom (UV grade) s excitáciou 254 nm. Čas použiteľnosti nie je obmedzený, taniere “ Sorbfil »Sú široko testované pri analýze derivátov aminokyselín, pesticídov, lipidov, antibiotík.

Uskutoční sa metóda TLC kvalitatívna identifikácia komponentov. kvantifikácia pre TLC je tiež možné, to vyžaduje aplikáciu presného množstva látky a ďalšie denzitometrické štúdie s jasnou fixáciou intenzity škvŕn. Najbežnejšie je semikvantitatívna metóda ... Je založená na vizuálne porovnanie veľkosť a intenzita škvrny komponentu so zodpovedajúcimi charakteristikami série škvŕn tej istej látky rôznych koncentrácií ( štandardné referenčné roztoky ). Pri použití vzorky v množstve 1-5 μg takouto jednoduchou metódou je presnosť stanovenia obsahu zložky cca 5-10%. Na stanovenie zložiek vo vzorke je často potrebné vykonať prípravu vzorky, aby sa získala zmes obsahujúca analyzované zlúčeniny. Príprava vzorky je založená na extrakcii liečiv zo vzorky organickými rozpúšťadlami ( n-hexán, petroléter, dietyléter, chloroform), čistenie extraktu a následná chromatografia na tenkej vrstve oxidu hlinitého alebo silikagélu.

Existuje niekoľko možností pre TLC a BH, ktoré sa líšia spôsobom zásobovanie rozpúšťadlami ... V závislosti od smeru pohybu mobilnej fázy existujú:

a)vzostupná chromatografia  mobilná fáza sa naleje na dno separačnej komory, papier (doska) sa položí vertikálne;

b)chromatografia zhora nadol  mobilná fáza sa privádza zhora a pohybuje sa nadol pozdĺž vrstvy sorbentu dosky alebo papiera;

v)radiálna chromatografia  horizontálny posun čela rozpúšťadla: mobilná fáza sa privedie do stredu papierového kotúča (dosky), kde sa nanesie zmes, ktorá sa má oddeliť.

Najbežnejšie je vzostupná elúcia (chromatografia). Predné eluent pri pohybe zdola nahor. Výber rozpúšťadla (mobilnej fázy) je určený povahou sorbentu a vlastnosťami separovaných látok.

Chromatografická separácia Metódy BC a TLC sa vykonávajú v separačná komora s lapovaným vekom. Kvantitatívna miera rýchlosti prenosu látky pri použití konkrétneho adsorbenta a rozpúšťadla je hodnota R f (z angl. zadržiavanie faktor Ak je koeficient oneskorenia, tento parameter je analogický s retenčným časom). pozícia zóny chromatografovaného komponentu nastaviť vo veľkosti koeficient R f ktorá sa rovná pomeru rýchlosti pohybu jej zóny k rýchlosti pohybu čela rozpúšťadla. Množstvo R f je vždy menšia ako jedna a nezávisí od dĺžky chromatogramu. Podľa množstva R f ovplyvňujú rôzne faktory. Takže pri nízkych teplotách sa látky pohybujú pomalšie; kontaminácia rozpúšťadiel, nehomogenita adsorbenta, cudzie ióny v analyzovanom roztoku môžu zmeniť hodnotu R f až 10 %. Vo vybranom systéme by mali mať analyty rôzne hodnoty. R f a distribuované po celej dĺžke chromatogramu. Je žiaduce, aby hodnoty R f ležal v rozmedzí 0,05-0,85.

V praxi hodnota R f vypočítané ako pomer vzdialenosti l prešiel látkou do diaľky L prešiel rozpúšťadlom:

R f = l / L (6.1 )

Zvyčajne si vyberajú pre výpočet stred bodu (obr. 1). Množstvo R f závisí od mnohých faktorov: typ chromatografický papier (jej pórovitosť, hustota, hrúbka, stupeň hydratácie) a sorbent (veľkosť zŕn, charakter skupín na povrchu, hrúbka vrstvy, obsah vlhkosti, povaha látky, zloženie mobilnej fázy), experimentálne podmienky (teplota, čas chromatografie atď.). Pri stálosti všetkých chromatografických parametrov je hodnota R f určené len individuálnymi vlastnosťami každého komponentu.

Ryža. 1. Stanovenie hodnôt na chromatograme Rf pre komponenty A a V,

stupeň ich oddelenia Rs a počet teoretických etáp N .

Účinnosť BC a TLC závisí aj od selektivita a citlivosť reakcie používané na detekciu zložiek analyzovanej zmesi. Zvyčajne sa používajú činidlá, ktoré tvoria farebné zlúčeniny  vývojky so zložkami, ktoré sa majú stanoviť. Pre spoľahlivejšie identifikáciu zdieľaných komponentov uplatniť " svedkov »Riešenia štandardné látky (v rovnakom rozpúšťadle ako vzorka), o ktorom sa očakáva, že bude prítomný vo vzorke. Štandardná látka aplikovaný na štartovaciu čiaru vedľa analyzovanej vzorky a chromatografovaný za rovnakých podmienok. V praxi sa často používa relatívna hodnota:

R f rel = R f X / R f stáť (6.2)

kde R f stáť vypočítané aj podľa vzorca (6.1). Efektívnosť chromatografická separácia charakterizovať počet ekvivalentných teoretických etáp a oni výška ... Pri TLC metóde je teda počet ekvivalentných teoretických poschodí N A pre komponent A zmes, ktorá sa má oddeliť, sa vypočíta podľa vzorca:

N A = 16 (l OA / a (A )) 2 (6.3)

Hodnoty l OA a a (A ) sa určuje tak, ako je znázornené na obr. 6.1. Potom výška ekvivalentnej teoretickej dosky H A je:

H A = l OA / N = a (A ) 2 / 16 l OA . (6.4)

Oddelenie je prakticky možné, ak R f (A)  R f (V)  0,1 .

Charakterizovať oddelenie týchto dvoch zložiek A a V použitie stupeň (kritérium) oddelenia Rs :

Rs =  l / (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l / (a (A) + a (B)) (6.5)

kde  l  vzdialenosť medzi stredmi škvŕn komponentov A a V;

a (A) a a (V)  bodové priemery A a V na chromatograme (obr. 6.1). Viac Rs , tým jasnejšie sú škvrny komponentov A a V na chromatograme. Podmienky chromatografia sú vybrané tak, že hodnota Rs sa líšila od nuly a jednotky, čo je optimálna hodnota Rs je 0,3  0,7. Pre sadzbu separačná selektivita dve zložky A a V použitie deliaci pomer α :

α = l B / l A (6.6)

Ak α = 1, potom zložky A a V nie sú zdieľané.

9801 0

HPLC je kvapalinová stĺpcová chromatografia, pri ktorej možno použiť rôzne sorpčné mechanizmy. HPLC je v podstate moderná forma implementácie klasickej kvapalinovej stĺpcovej chromatografie. Niektoré z najvýznamnejších kvalitatívnych charakteristík HPLC sú uvedené nižšie:
- vysoká rýchlosť procesu, ktorá umožnila skrátiť čas separácie z niekoľkých hodín a dní na minúty;
- minimálny stupeň difúzie chromatografických zón, ktorý umožňuje oddeliť zlúčeniny, ktoré sa len málo líšia v sorpčných konštantách;
- vysoký stupeň mechanizácie a automatizácie separácie a spracovania informácií, vďaka čomu kvapalinová stĺpcová chromatografia dosiahla novú úroveň reprodukovateľnosti a presnosti.

Intenzívne štúdie posledných desaťročí, obrovské množstvo nahromadených experimentálnych údajov dnes umožňuje hovoriť o klasifikácii variantov v rámci metódy vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Samozrejme, v tomto prípade zostáva v platnosti vyššie uvedená klasifikácia sorpčným mechanizmom.

Rozšírená klasifikácia je založená na porovnávacej polarite mobilnej a stacionárnej fázy. V tomto prípade sa rozlišuje medzi normálnou a reverznou fázovou chromatografiou.

Chromatografia na normálnej fáze (NPC) je variantom HPLC, kde je mobilná fáza menej polárna ako stacionárna a existuje dôvod domnievať sa, že hlavným faktorom určujúcim retenciu je interakcia sorbátov priamo s povrchom alebo objemom sorbentu.

Chromatografia na reverznej fáze (RPC) je variantom HPLC, kedy je mobilná fáza polárnejšia ako stacionárna a retencia je určená priamym kontaktom molekúl sorbátu s povrchom alebo objemom sorbentu; v tomto prípade sa ionizované sorbáty nevymieňajú za ióny mobilnej fázy sorbované na povrchu.

Ionexová chromatografia - variant, pri ktorom sa sorpcia uskutočňuje výmenou adsorbovaných iónov mobilnej fázy za ióny chromatografovaných látok; úplne analogicky môžete definovať chromatografiu na výmenu ligandov.

Chromatografia na dynamicky modifikovaných sorbentoch je variantom HPLC, pri ktorej sorbát neinteraguje priamo s povrchom sorbentu, ale vstupuje do asociácie s molekulami povrchových vrstiev eluentu.
Iónová párová chromatografia je variant reverznej fázovej chromatografie ionizovaných zlúčenín, pri ktorej sa do mobilnej fázy pridáva hydrofóbny protiión, ktorý kvalitatívne mení sorpčné charakteristiky systému.

Veľkostne vylučovacia chromatografia je metóda na separáciu zlúčenín podľa ich molekulových hmotností, založená na rozdiele v rýchlosti difúzie molekúl rôznych veľkostí v póroch stacionárnej fázy.

Pre HPLC je veľmi dôležitou charakteristikou veľkosť sorbentov, zvyčajne 3-5 mikrónov, teraz až 1,8 mikrónov. To umožňuje rýchle a úplné oddelenie zložitých zmesí látok (priemerný čas analýzy od 3 do 30 minút).

Separačný problém sa rieši pomocou chromatografickej kolóny, čo je trubica naplnená sorbentom. Počas analýzy sa kvapalina (eluent) určitého zloženia privádza cez chromatografickú kolónu konštantnou rýchlosťou. Do tohto prúdu sa vstrekuje presne odmeraná dávka vzorky. Zložky vzorky vnesené do chromatografickej kolóny sa v dôsledku svojej rôznej afinity k sorbentu kolóny pohybujú pozdĺž nej rôznymi rýchlosťami a dostávajú sa k detektoru postupne v rôznych časových bodoch.

Chromatografická kolóna je teda zodpovedná za selektivitu a separačnú účinnosť zložiek. Výberom rôznych typov kolón môžete ovládať stupeň separácie analytov. Zlúčeniny sú identifikované podľa ich retenčného času. Kvantitatívne stanovenie každej zo zložiek sa vypočíta na základe hodnoty analytického signálu nameraného detektorom pripojeným k výstupu z chromatografickej kolóny.

Sorbenty. Rozvoj HPLC je vo veľkej miere spojený s vytvorením nových generácií sorbentov s dobrými kinetickými vlastnosťami a rôznymi termodynamickými vlastnosťami. Hlavným materiálom pre sorbenty v HPLC je silikagél. Je mechanicky pevný, má výraznú pórovitosť, čo dáva veľkú výmennú kapacitu pri malej veľkosti kolóny. Najbežnejšia veľkosť častíc je 5-10 mikrónov. Čím bližšie k guľovitému tvaru častíc, tým nižší je odpor prúdenia, tým vyššia je účinnosť, najmä ak sa preosieva veľmi úzka frakcia (napríklad 7 + 1 μm).

Špecifický povrch silikagélu je 10-600 m / g. Silikagél môže byť modifikovaný rôznymi chemickými skupinami navrúbľovanými na povrch (C-18, CN, NH2, SO3H), čo umožňuje použiť sorbenty na jeho báze na separáciu širokej škály tried zlúčenín. Hlavnou nevýhodou silikagélu je jeho nízka chemická odolnosť pri pH< 2 и рН >9 (oxid kremičitý sa rozpúšťa v zásadách a kyselinách). Preto sa v súčasnosti intenzívne hľadajú sorbenty na báze polymérov, ktoré sú stabilné pri pH od 1 do 14, napríklad na báze polymetylmetakrylátu, polystyrénu atď.

Sorbenty pre iónomeničovú chromatografiu. Vzhľadom na zvláštnosti separácie (v kyslom alebo alkalickom prostredí) je hlavným sorbčným materiálom polystyrén s divinylbenzénom rôzneho stupňa zosieťovania so skupinami SO3 -H + navrúbľovanými na ich povrch (silne kyslé katexy) alebo -СОО-Naf. (slabo kyslé katexy), -H2N + (CH3) 3Cl- (silne zásadité aniónomeniče) alebo -N + HR2Cl- (slabo zásadité aniónomeniče).

Sorbenty pre gélovú permeačnú chromatografiu. Hlavným typom je styrén-DVB. Používajú sa aj makroporézne sklá, metylmetakrylát, silikagél. Rovnaké sorbenty sa používajú na iónovo-vylučovaciu chromatografiu.
Čerpadlá. Na zabezpečenie prietoku mobilnej fázy (PF) kolónou so špecifikovanými parametrami sa používajú vysokotlakové čerpadlá. Najdôležitejšie technické charakteristiky čerpadiel LC sú: rozsah prietoku; maximálny pracovný tlak; reprodukovateľnosť toku; rozsah pulzácií prívodu rozpúšťadla.

Podľa povahy prívodu rozpúšťadla môžu mať čerpadlá konštantný prívod (prietok) a konštantný tlak. V zásade sa pre analytickú prácu používa konštantný prietok pri plnení kolón - konštantný tlak. Podľa princípu činnosti sú čerpadlá rozdelené na injekčné a piestové čerpadlá.

Injekčné pumpy. Čerpadlá tohto typu sa vyznačujú takmer úplnou absenciou pulzácií toku mobilnej fázy počas prevádzky. Nevýhody čerpadla: a) veľká spotreba času a rozpúšťadla na preplachovanie pri výmene rozpúšťadla; b) pozastavenie separácie počas plnenia čerpadla; c) veľké rozmery a hmotnosť pri zabezpečení vysokého prietoku a tlaku (potrebujete silný motor a veľkú silu piestu pri jeho veľkej ploche).

Piestové piestové čerpadlá. Čerpadlá tohto typu zabezpečujú konštantný objemový prietok mobilnej fázy po dlhú dobu. Maximálny pracovný tlak je 300-500 atm, prietok 0,01-10 ml / min. Reprodukovateľnosť objemového prívodu je 0,5 %. Hlavnou nevýhodou je, že rozpúšťadlo je privádzané do systému vo forme série po sebe nasledujúcich impulzov, preto dochádza k pulzáciám tlaku a prietoku.

To je hlavný dôvod zvýšeného šumu a zníženej citlivosti takmer všetkých detektorov používaných v LC, najmä elektrochemických. Metódy riešenia pulzácií: pomocou dvojitých čerpadiel alebo dvojpiestového čerpadla Bug-lai, pomocou tlmiacich zariadení a elektronických zariadení.

Objemový prietok je určený tromi parametrami: priemerom piestu (zvyčajne 3,13; 5,0; 7,0 mm), jeho amplitúdou (12-18 mm) a frekvenciou (ktorá závisí od rýchlosti otáčania motora a prevodovky).

Dávkovače. Účelom dávkovača je preniesť vzorku pri atmosférickom tlaku na vstup do kolóny pri tlakoch až niekoľko atmosfér. Je dôležité, aby dávkovač neobsahoval „mŕtve“ objemy, ktoré nie sú preplachované mobilnou fázou a riedením vzorky počas dávkovania. Najprv boli dávkovače v LC podobné dávkovačom plynu s membránovým prepichnutím. Membrány však nedržia viac ako 50-100 atm, ich chemická odolnosť je nedostatočná, ich kusy znečisťujú kolónové filtre a kapiláry.

V kvapalnej fáze je rýchlosť difúzie oveľa nižšia ako v plynnej fáze. Preto je možné upustiť od zastavenia prietoku - vzorka sa nestihne vymyť v dávkovači. Počas vstrekovania vzorky do dávkovača špeciálny ventil blokuje prietok rozpúšťadla. Tlak na vstupe do kolóny rýchlo klesá, po niekoľkých sekundách je možné vzorku vstreknúť do komory dávkovača pomocou bežnej mikrostriekačky. Potom je dávkovač uzamknutý, prietok rozpúšťadla je zapnutý a prebieha separácia.

Tlak, ktorý tento ventil drží, je až 500-800 atm. Ale keď sa prietok zastaví, rovnováha v kolóne sa naruší, čo môže viesť k objaveniu sa „prázdnych“ ďalších píkov.

Najpoužívanejšie sú slučkové dávkovače. Pri plnení dávkovača pod vysokým tlakom sa objavia vstupy 1, 2 a kanál medzi nimi. Vstupy 3-6, kanály medzi nimi a dávkovacia slučka sú pod atmosférickým tlakom, čo umožňuje naplnenie slučky injekčnou striekačkou alebo pumpou. Keď sa dávkovač otočí, prúd mobilnej fázy vytlačí vzorku do kolóny. Na zníženie chyby sa slučka premyje 5-10-násobkom objemu vzorky. Ak je vzorka malá, môže sa vstreknúť do slučky pomocou mikrostriekačky. Objem slučky je zvyčajne 5-50 μl.

ON. Voinov, T.G. Volova