KINETIKA ENZYMATICKÝCH REAKCIÍ
študuje vzorce priebehu enzymatických okresov v čase, ako aj ich mechanizmus; kapitola kinetika chemikálií.
Katalytický cyklus premeny S-ostrovov (substrátu) na produkt P pôsobením enzýmu E prebieha za vzniku medziproduktu. spoj. X i:
kde ki - rýchlostné konštanty jednotlivých základných stupňov,
tvorba komplexu enzým-substrát X 1 (ES, Michaelisov komplex).
Pri danom t-re závisí rýchlosť pcie od koncentrácií enzýmu, substrátu a zloženia média. Rozlišujte stacionárnu, pre-stacionárnu a relaxačnú kinetiku enzymatických roztokov.
Stacionárna kinetika. V stacionárnom stave na medziľahlom spojení. (dX i/dt= 0, i = 1, ..., n) a s prebytkom substrátu, kde [S] 0 a [E] 0 sú počiatočné koncentrácie. substrát a enzým, kinetika procesu je charakterizovaná konštantnou, v priebehu času nezmenenou úrovňou koncentrácií interm. spoj. a výraz pre rýchlosť procesu v 0, volal. počiatočná stacionárna rýchlosť, má tvar (ur-Michaelis-Menten):
(1)
kde hodnoty kcat a K m -> frakcia rýchlostných konštánt elementárnych stupňov je daná rovnicami:
Hodnota k kat
zavolal účinný katalyzátor. konštanta procesnej rýchlosti, parameter K m -> Michaelisova konštanta. K mačka hodnota
je určený hodnotami naib. pomalé stupne katalyzátora. p-tions a niekedy nazývané. počet otáčok enzýmu (enzýmový systém); k kat
charakterizuje počet katalytických. cyklov vykonaných enzýmovým systémom za jednotku času. Naib. rozšírené, majúce hodnotu k kat. pre konkrétne substráty v rozmedzí 10 2 -10 3 s -1. Typické hodnoty Michaelisovej konštanty sú v rozmedzí 10-3 -10-4 M.
Nazýva sa to pri vysokých koncentráciách substrátu, keď rýchlosť pohybu p-látky nezávisí od koncentrácie substrátu a dosahuje konštantnú hodnotu. Max. rýchlosť. Graficky je Michaelisova rovnica - Menten hyperbola. Je možné ho linearizovať pomocou metódy dvojitých recipročných hodnôt (metóda Lineuy-vera-Burk), tj. Zostrojením závislosti 1 / v na 1 / [S] 0 alebo inými metódami. Lineárna forma močenia (1) má tvar:
(2)
Umožňuje graficky definovať hodnoty K m a v max (obr. 1).
Ryža. 1. Graf lineárnej transformácie Michaelisovej - Mentenovej rovnice v dvojnásobných recipročných hodnotách (podľa Lineweaver - Burke).
Množstvo K m> je číselne rovná koncentrácii substrátu, pri ktorej je rýchlosť p-tácie rovnaká K mčasto slúži ako miera afinity substrátu a enzýmu, ale platí to iba vtedy, ak
Množstvá K m> a sa líši podľa hodnôt pH. Je to spôsobené schopnosťou skupín molekúl enzýmu zapojených do katalýzy zmeniť svoj stav ionizácie, a tým aj svoju katalytickú aktivitu. účinnosť. V najjednoduchšom prípade zmena pH vedie k protonizácii alebo deprotonizácii najmenej dvoch ionizovateľných skupín enzýmu zapojeného do katalýzy. Ak je v tomto prípade iba jedna forma komplexu enzým-substrát (napríklad ESH) z troch možných (ES, ESH a ESH 2) schopná premeniť sa na produkt p-časti, potom závislosť rýchlosť pH je popísaná ph vrstvou:
kde f = 1 + / a f " = 1 +
+ K " b />-T. zavolal pH-funkcia Michaelis a K a, K b a K "a, K" b -> ionizačné konštanty skupín a a b zadarmo enzým a komplex enzým-substrát. Na súradniciach lg - táto závislosť na pH je znázornená na obr. 2, a tangenty svahov dotyčníc k vzostupným, nezávisle od pH, a zostupných vetiev krivky by sa mali rovnať +1, 0, respektíve -1. Z takého grafu môžete určiť hodnoty pK a skupiny zapojené do katalýzy.
Ryža. 2. Závislosť katalyzátora. konštanty od pH do logaritmu. súradnice.
Rýchlosť enzymatického okresu nie vždy podlieha urgencii (1). Jeden z najčastejších prípadov - účasť na okresnom alosterichu. enzýmy (pozri. Regulátory enzýmov), pre ryh je závislosť stupňa nasýtenia enzýmu na [S] 0 nehyperbolická. znak (obr. 3). Tento jav je spôsobený kooperativitou väzby substrátu, t. J. Keď sa väzba substrátu na jednom z miest makromolekuly enzýmu zvyšuje (pozitívna kooperativita) alebo znižuje (negatívna kooperativita) afinitu k substrátu iného miesta.
Ryža. Závislosť stupňa nasýtenia enzýmu substrátom na koncentrácii substrátu s pozitívnou (I) a negatívnou (II) kooperativitou, ako aj v jeho neprítomnosti (III).
Predstacionárna kinetika. Pri rýchlom miešaní roztokov enzýmov a substrátov v časovom intervale 10 -6 -10 -1 s je možné pozorovať prechodné procesy predchádzajúce vzniku stabilného stacionárneho stavu. V tomto pred-stacionárnom režime, keď sa používa veľký prebytok substrátu, diferenciálny systém. ur-niy, popisujúca kinetiku procesov, je lineárna. Riešenie tohto typu sústavy lineárnych diferenciálov. ur-ny je dané súčtom exponenciálnych výrazov. Takže pre kinetiku. podľa vyššie uvedenej schémy má kinetika akumulácie produktu formu:
kde i ->, b, a n -> frakcia elementárnych rýchlostných konštánt; -korene zodpovedajúcej charakteristiky. ur-niya.
Obojstranné sa nazýva. charakteristický čas spracovania:
Pre okres postupujúc za účasti n medzi. conn., môžete sa stať ncharakteristickými. krát.
Štúdium kinetiky enzymatického roztoku v pred-stacionárnom režime vám umožňuje získať predstavu o podrobnom mechanizme katalyzátora. cyklu a určte rýchlostné konštanty základných fáz procesu.
Experimentálne sa kinetika enzymatického roztoku v pred-stacionárnom režime skúma pomocou metódy zastaveného prúdu (pozri. Jet kinetické metódy),čo umožňuje zmiešať komponenty pcie do 1 ms.
Kinetika relaxácie. Pri rýchlom rušivom účinku na systém (zmena t-ry, tlaku, elektrického. Poľa) závisí čas, ktorý systém potrebuje na dosiahnutie novej rovnováhy alebo stacionárneho stavu, od rýchlosti procesov, ktoré určujú katalytický. enzymatický cyklus.
Systém rovníc popisujúcich kinetiku procesu je lineárny, ak je posun z rovnovážnej polohy malý. Riešenie systému vedie k závislosti koncentrácií rozkladných zložiek. etapy procesu vo forme súčtu exponenciálnych výrazov, ktorých exponenty majú charakter relaxačných časov. Výsledkom štúdie je spektrum relaxačných časov zodpovedajúce počtu medziproduktov. zapojené do procesu. Relaxačné časy závisia od rýchlostných konštánt základných fáz procesov.
Relaxačné metódy kinetika umožňuje stanoviť rýchlostné konštanty jednotlivých elementárnych stupňov transformácie medziproduktov. Metódy štúdia relaxačnej kinetiky sú rôzne. rozlíšenie: absorpcia ultrazvukom -10 -6 -10 -10
s, teplotný skok -1O -4 -10 -6 s, elektrická metóda. pulz -10 -4 -10 -6 s, tlakový skok -10 -2 s. Pri štúdiu kinetiky enzymatických roztokov naib našla metóda teplotného skoku uplatnenie.
Makrokinetika enzymatických procesov. Vývoj metód na získanie heterogénnych katalyzátorov imobilizáciou enzýmov pri rozklade. nosiče (viď. Imobilizované enzýmy) bolo nevyhnutné analyzovať kinetiku procesov s prihliadnutím na prenos hmoty substrátu. Zákonitosti kinetiky p-tónov, berúc do úvahy účinky difúznej vrstvy a pre systémy s intradifúznymi ťažkosťami v distribúcii enzýmu vo vnútri nosiča, boli teoreticky a experimentálne skúmané.
Za podmienok, keď je kinetika procesu ovplyvnená difúznym prenosom substrátu, katalytického. účinnosť systému klesá. Faktor účinnosti sa rovná pomeru hustoty toku produktu v podmienkach enzymatického roztoku s koncentráciou substrátu redukovanou difúziou k prietoku, čo bolo možné dosiahnuť bez obmedzenia difúzie. V čisto difúznej oblasti, keď je rýchlosť procesu určená prenosom hmoty substrátu, je faktor účinnosti pre systémy s externou inhibíciou difúzie nepriamo úmerný difúznemu modulu:
kde
hrúbka difúznej vrstvy, D - koeficient. difúzia substrátu.
Pre systémy s intradifúznym brzdením v p-tónoch prvého rádu
kde f T- bezrozmerný modul (modul Thiele).
Pri analýze kinetiky. vzorce v enzymatických reaktoroch široké teoretické. a experimentovať. vývoj bol prijatý „ideálnymi“ modelmi reaktorov, prietokovými (prietokový reaktor ideálneho miešania), prietokovým reaktorom s ideálnym výtlakom a membránovým reaktorom.
Kinetika polyenzymových procesov. V tele (bunke) enzýmy nepôsobia izolovane, ale katalyzujú transformačné reťazce molekúl. P-ácia v polyenzymových systémoch s kinetickou. svoje uhly pohľadu možno považovať za konzistentné. procesy, špecifické rysom cyklu sú enzýmy každého z týchto štádií:
kde ,
prísl. max, rýchlosť procesu a Michaelisova konštanta i etapa okresu, resp.
Dôležitá funkcia proces - možnosť vytvorenia stabilného stacionárneho stavu. Podmienkou jej vzniku môže byť nerovnosť > v 0, kde v 0 je rýchlosť obmedzujúceho stupňa, charakterizovaná najmenšou rýchlostnou konštantou, a tým určujúca rýchlosť všetkých nasledujúcich. proces. V rovnovážnom stave je koncentrácia metabolitov po limitnom štádiu nižšia ako Michaelisova konštanta zodpovedajúceho enzýmu.
Konkrétne. skupina polyenzymových systémov pozostáva zo systémov, ktoré vykonávajú oxidačnú redukciu. p-za účasti proteínových nosičov elektrónov. Nosiče tvoria špecifikum. štruktúry, komplexy s deterministickou postupnosťou prenosu elektrónov. Kinetický. popis tohto druhu systémov považuje stav obvodov s rozkladom za nezávislú premennú. stupeň populácie elektrónov.
Aplikácia. F. r. pretože sú vo výskumnej praxi široko používané na štúdium mechanizmov účinku enzýmov a enzýmových systémov. Prakticky významnou oblasťou enzýmovej vedy je inžinierska enzymológia, operuje s konceptmi F. r. optimalizovať biotechnológie. procesy.
Lit.: Poltorak O. M., Chukhrai E. S, Fyzikálno-chemické základy enzymatickej katalýzy, M., 1971; Berezin IV, Martinek K, Základy fyzikálnej chémie enzymatickej katalýzy, M., 1977; Varfolomeev S.D., Zaitsev S.V., Kinetické metódy v biochemický výskum, M .. 1982. S. D. Varfolomeev.
Chemická encyklopédia. - M.: Sovietska encyklopédia. Ed. I. L. Knunyants. 1988 .
Pozrite sa, čo je „ENZYMATÍVNE KINETICKÉ REAKCIE“ v iných slovníkoch:
Katalytický pomer cyklický. proces pozostávajúci z niekoľkých elementárnych jednotiek, ktorých rýchlosti sú pôsobiacimi masami popísané zákonom. Tento zákon má jednoduchú formu ideálnych plynných zmesí, ideálnych veľkostí a ideálnych povrchových vrstiev ... ... Chemická encyklopédia
Kinetika chemických reakcií, doktrína chemických procesov o zákonitostiach ich priebehu v čase, rýchlostiach a mechanizmoch. Najdôležitejšie oblasti modernej chémie a chémie ... ... Veľká sovietska encyklopédia
KINETIKA CHEMICKÁ- (z gréckeho. kinezického hnutia), odbor teoretickej chémie, venovaný štúdiu zákonov chémie. reakcie. Je možné načrtnúť niekoľko typov chemikálií. interakcie a v prvom rade odlíšiť reakcie prebiehajúce v homogénnom (homogénnom) médiu od reakcií, ... ... Veľký lekárska encyklopédia
- (biokatalýza), zrýchlenie biochémie. dávka za účasti proteínových makromolekúl nazývaných enzýmy (enzýmy). F. to. Druh katalýzy, aj keď termín fermentácia (fermentácia) je známy už od staroveku, keď ešte neexistoval pojem chemický. katalýza. Najprv… … Chemická encyklopédia
- (z latinčiny. predpona re, čo znamená opačný dej a dejový dej), premena niektorých na (počiatočné zlúčeniny) v iné (rádioaktívne produkty), zatiaľ čo jadrá atómov zostávajú nezmenené (na rozdiel od jadrových reakcií). Počiatočné spojenia v R. x. niekedy sa nazýva ... ... Chemická encyklopédia
- (z latinského kvasu fermentum) (enzýmy), bielkoviny, ktoré pôsobia ako katalyzátory v živých organizmoch. Hlavná funkcie F. urýchľovať transformáciu na, vstupujúce do tela a formované počas metabolizmu (na obnovu bunkových štruktúr, na zaistenie ... Chemická encyklopédia
- (z gréckej farmakonskej medicíny a kinetikos sa dáva do pohybu), študuje kinetiku. vzory procesov prebiehajúcich s lek. Wed vom v tele. Hlavná farmakokinetické. procesy: absorpcia, distribúcia, metabolizmus a vylučovanie (vylučovanie) ... ... Chemická encyklopédia
Táto časť enzymológie študuje vplyv rôznych faktorov na rýchlosť enzymatickej reakcie. Berúc do úvahy všeobecnú rovnicu enzymatickej katalýzy reverzibilnej reakcie premeny jedného substrátu na jeden produkt (1),
treba pomenovať hlavné faktory ovplyvňujúce rýchlosť enzymatickej reakcie: koncentrácia substrátu [S], koncentrácia enzýmu [E] a koncentrácia reakčného produktu [P].
Interakciu niektorých enzýmov s ich substrátom je možné popísať hyperbolickou krivkou závislosti rýchlosti enzymatickej reakcie V od koncentrácie substrátu [S] (obr. 19):
Obr. 19 Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu.
Na tejto krivke je možné rozlíšiť tri oblasti, ktoré je možné vysvetliť polohami mechanizmu interakcie enzýmu so substrátom: OA - oblasť priamo úmernej závislosti V na [S], dochádza k postupnému vypĺňaniu aktívne centrá enzýmu s molekulami substrátu s tvorbou nestabilného ES komplexu; sekcia AB - krivočará závislosť V na [S], úplná saturácia aktívnych centier enzýmu molekulami substrátu ešte nebola dosiahnutá. ES komplex pred dosiahnutím prechodný stav je nestabilný, pravdepodobnosť reverznej disociácie k E a S je stále vysoká; rez ВС - závislosť je popísaná rovnicou nulového rádu, rez je rovnobežný s osou [S], dosiahne sa plná saturácia aktívne enzýmy molekuly substrátu, V = V max.
Charakteristický tvar krivky je matematicky popísaný Briggsovou-Haldanovou rovnicou:
V = V max ● [S] / Km + [S] (2),
kde Km je Michaelis-Mentenova konštanta, číselne rovnaká ako koncentrácia substrátu, pri ktorej je rýchlosť enzymatickej reakcie polovičná V max.
Čím nižšia je Km enzýmu, tým vyššia je afinita enzýmu k substrátu, tým rýchlejšie sa dosiahne prechodový stav pre substrát a zmení sa na reakčný produkt. Nájdenie hodnôt Km pre každý zo skupinovo špecifických enzýmových substrátov je dôležité pri určovaní biologickú úlohu tohto enzýmu v bunke.
Pre väčšinu enzýmov nie je možné zostrojiť hyperbolickú krivku (obr. 19). V tomto prípade sa používa metóda dvojitej recipročnej (Lineuyver-Burke) je vybudovaná grafická závislosť 1 / [V] na 1 / [S] (obr. 20). Metóda zostrojenia takýchto kriviek v experimente je veľmi výhodná pri štúdiu účinku rôznych typov inhibítorov na aktivitu enzýmov (pozri nižšie v texte).
Obr. 20. Graf závislosti 1 / [V] od 1 / [S] (metóda Lineweaver-Burke),
kde y je hraničná oblasť -a x je medzná oblasť - 
, dotyčnica uhla α -.
Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie V od koncentrácie enzýmu [E].
Táto grafická závislosť (obr. 21) sa zvažuje pri optimálnej teplote a pH. životné prostredie, pri koncentráciách substrátu výrazne prevyšujúcich koncentráciu nasýtenia aktívnych miest enzýmu.
Ryža. 21. Vplyv koncentrácie enzýmu na rýchlosť enzymatickej reakcie.
Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie kofaktora alebo koenzýmu. Pri komplexných enzýmoch je potrebné mať na pamäti, že nedostatok koenzýmových foriem vitamínov pri hypovitaminóze, porušenie príjmu kovových iónov do tela nevyhnutne vedie k zníženiu koncentrácie zodpovedajúcich enzýmov potrebných na priebeh metabolizmu. procesy. Preto by sa malo dospieť k záveru, že aktivita enzýmu je priamo závislá od koncentrácie kofaktoru alebo koenzýmu.
Vplyv koncentrácie produktov na rýchlosť enzymatickej reakcie. Pri reverzibilných reakciách v ľudskom tele je potrebné vziať do úvahy, že produkty priamej reakcie môže enzým použiť ako substráty pre reverznú reakciu. Preto je smer toku a moment dosiahnutia Vmax závislý na pomere koncentrácií počiatočných substrátov a reakčných produktov. Napríklad aktivita alanínaminotrasferázy, ktorá katalyzuje transformáciu:
Alanín + alfa -ketoglutarát ↔ pyruvát + glutamát
závisí od koncentrácie v bunke:
[alanín + alfa -ketoglutarát] / [pyruvát + glutamát].
MECHANIZMUS AKCIE ENZYMU. TEÓRIA ENZYMATÍVNEJ KATALÝZY
Enzýmy, podobne ako nebielkovinové katalyzátory, zvyšujú rýchlosť chemická reakcia vďaka schopnosti znížiť aktivačnú energiu tejto reakcie. Aktivačná energia enzymatickej reakcie sa vypočíta ako rozdiel medzi hodnotou energie v systéme prebiehajúcej reakcie, ktorá dosiahla prechodný stav, a energiou určenou na začiatku reakcie (pozri grafickú závislosť na obr. 22).
Ryža. 22. Grafická závislosť energetického stavu chemickej reakcie bez enzýmu (1) a v prítomnosti enzýmu (2) od reakčného času.
Práce W. Henryho a najmä L. Michaelisa, M. Mentena o štúdiu mechanizmu reverzibilných enzymatických reakcií monosubstrátu umožnili predpokladať, že enzým E sa najskôr reverzibilne a relatívne rýchlo spojí so svojim substrátom S za vzniku komplex enzým-substrát (ES):
E + S.<=>ES (1)
K tvorbe ES dochádza v dôsledku vodíkových väzieb, elektrostatických, hydrofóbnych interakcií, v niektorých prípadoch kovalentných, koordinačných väzieb medzi bočnými radikálmi aminokyselinových zvyškov aktívneho centra a funkčnými skupinami substrátu. V komplexných enzýmoch môže funkciu kontaktu so substrátom vykonávať aj nebielkovinová časť štruktúry.
Komplex enzým-substrát sa potom rozloží v druhej pomalšej reverzibilnej reakcii za vzniku reakčného produktu P a voľného enzýmu E:
ES<=>EP<=>E + P (2)
V súčasnej dobe vďaka práci vyššie uvedených vedcov, ako aj Keilina D., Chance B., Koshlanda D. (teória „indukovanej korešpondencie“), existujú teoretické ustanovenia o štyroch hlavných bodoch mechanizmu účinku enzýmu na substráte, ktoré určujú schopnosť enzýmov urýchľovať chemické reakcie:
1. Orientácia a konvergencia ... Enzým je schopný viazať molekulu substrátu tak, že väzba napadnutá enzýmom sa nachádza nielen v bezprostrednej blízkosti katalytickej skupiny, ale je voči nej aj správne orientovaná. Pravdepodobnosť, že komplex ES dosiahne orientáciu a prístup, dosiahne prechodný stav, sa výrazne zvyšuje.
2. Stres a napätie : vyvolaná korešpondencia. Pripojenie substrátu môže spôsobiť konformačné zmeny v molekule enzýmu, ktoré vedú k napätiu v štruktúre aktívneho centra, a tiež trochu deformovať viazaný substrát, čím sa uľahčuje dosiahnutie prechodného stavu komplexom ES. Medzi molekulami E a S existuje takzvaná indukovaná korešpondencia.
A). Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od množstva enzýmov
Pri uskutočňovaní enzymatickej reakcie za podmienok prebytočného substrátu bude reakčná rýchlosť závisieť od koncentrácie enzýmu. Grafická závislosť takejto reakcie má formu priamky. Množstvo enzýmu však často nie je možné určiť v absolútnych číslach, preto sa v praxi používajú konvenčné hodnoty charakterizujúce aktivitu enzýmu: jedna medzinárodná jednotka aktivity (ME) zodpovedá množstvu enzýmu, ktorý katalyzuje premenu 1 μmol substrátu za 1 minútu za optimálnych podmienok pre enzymatickú reakciu. Optimálne podmienky sú pre každý enzým individuálne a závisia od teploty média, pH roztoku, v neprítomnosti aktivátorov a inhibítorov.
Závislosť akumulácie produktu (A) a straty substrátu (B) na čase (trvaní) reakcie... Rýchlosť enzymatickej reakcie je určená zmenou koncentrácie produktu alebo substrátu za jednotku času. Pri reakciách katalyzovaných enzýmami 1 a 2 je počiatočná rýchlosť reakcie katalyzovanej enzýmom 1 nižšia ako rýchlosť reakcie katalyzovanej enzýmom 2, pretože dotyčnica sklonu dotyčnice ku krivke reakčného profilu odvodená z „ O "bod druhého enzýmu je vyšší, ako v prípade akumulácie produktu (A) a straty substrátu (B). Rýchlosť v ľubovoľnom čase t je určená dotyčnicou uhla sklonu dotyčnice k reakčnému profilu v čase t. Časové obdobie enzymatickej reakcie je charakterizované lineárnou akumuláciou produktu (alebo stratou substrátu) v závislosti od trvania reakcie. Obdobie enzymatickej reakcie je charakterizované nelineárnou akumuláciou produktu (alebo stratou substrátu) v závislosti od reakčného času.
Počet jednotiek aktivity nME je určený vzorcom:
B). Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od teploty média
Zvýšenie teploty na určité limity ovplyvňuje rýchlosť enzýmov
reakcie sú podobné účinku teploty na akúkoľvek chemickú reakciu. So zvýšením teploty sa pohyb molekúl zrýchľuje, čo vedie k zvýšeniu pravdepodobnosti interakcie reagujúcich látok. Teplota môže navyše zvýšiť energiu reagujúcich molekúl, čo tiež urýchľuje reakciu. Rýchlosť chemickej reakcie katalyzovanej enzýmami má však svoje vlastné teplotné optimum, ktorého prebytok je sprevádzaný poklesom enzymatickej aktivity vyplývajúcej z tepelnej denaturácie molekuly proteínu
Pre väčšinu ľudských enzýmov je optimálna teplota 37-38 ° C. Termostabilné enzýmy však existujú aj v prírode. Napríklad polymeráza Taq, izolovaná z mikroorganizmov žijúcich v horúcich prameňoch, nie je deaktivovaná, keď teplota stúpne na 95 ° C. Tento enzým sa používa vo vedeckej a praktickej medicíne na molekulárnu diagnostiku chorôb metódou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).
V). Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od množstva substrátu
S nárastom množstva substrátu sa počiatočná rýchlosť zvyšuje. Keď sa enzým úplne nasýti substrátom, t.j. k maximálnej možnej tvorbe komplexu enzým-substrát dochádza pri danej koncentrácii enzýmu, je pozorovaná najvyššia rýchlosť tvorby produktu. Ďalšie zvýšenie koncentrácie substrátu nevedie k zvýšeniu tvorby produktu, t.j. rýchlosť reakcie sa nezvyšuje. Tento stav zodpovedá maximálnej reakčnej rýchlosti Vmax.
Koncentrácia enzýmu je teda limitujúcim faktorom pri tvorbe produktu. Toto pozorovanie tvorilo základ enzymatickej kinetiky vyvinutej vedcami L. Michaelisom a M. Mentenom v roku 1913.
Rýchlosť reakcie je úmerná koncentrácii komplexu enzým-substrát ES a rýchlosť tvorby ES závisí od koncentrácie substrátu a koncentrácie voľného enzýmu. Koncentrácia ES je ovplyvnená rýchlosťou tvorby a rozkladu ES.
Najvyššia reakčná rýchlosť sa pozoruje, keď sú všetky molekuly enzýmu v komplexe so substrátom, t.j. v komplexe enzým-substrát ES, t.j. [E] =.
Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu je vyjadrená nasledujúcou rovnicou (matematické odvodenie tohto vzorca nájdete v príručkách k enzymatickej kinetike):
V = Vmax [S] / km + [S]
Táto rovnica sa nazýva Michaelis-Mentenova rovnica.
Michaelis-Mentenova rovnica je základnou rovnicou enzymatickej kinetiky, ktorá popisuje závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu.
Ak je koncentrácia substrátu výrazne vyššia ako Km (S >> Km), potom zvýšenie koncentrácie substrátu o hodnotu Km prakticky neovplyvní súčet (Km + S) a možno ho považovať za rovný koncentrácia substrátu. V dôsledku toho sa reakčná rýchlosť rovná maximálnej rýchlosti: V = Vmax. Za týchto podmienok má reakcia nulový poriadok, t.j. nezávisí od koncentrácie substrátu. Možno usúdiť, že Vmax je konštantná hodnota pre danú koncentráciu enzýmu, nezávislá od koncentrácie substrátu.
Ak je koncentrácia substrátu výrazne nižšia ako Km (S.<< Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).
Vmax a Km - kinetické charakteristiky účinnosti enzýmu.
Vmax charakterizuje katalytickú aktivitu enzýmu a má rozmer rýchlosti enzymatickej reakcie mol / L, t.j. určuje maximálnu možnosť tvorby produktu pri danej koncentrácii enzýmu a za podmienok prebytočného substrátu. Km charakterizuje afinitu daného enzýmu k danému substrátu a je konštantnou hodnotou, ktorá nezávisí od koncentrácie enzýmu. Čím nižšia je Km, tým väčšia je afinita enzýmu k danému substrátu, tým vyššia je počiatočná reakčná rýchlosť a naopak, čím vyššia je Km, tým nižšia je počiatočná reakčná rýchlosť, tým nižšia je afinita enzýmu k substrátu.
Rýchlosť enzymatických reakcií závisí od koncentrácie sub-
vrstva. Táto závislosť je komplexná, čo je pre určité enzýmy popísané parabolickou krivkou (obr. 29).
Obrázok 29 - Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie
na koncentrácii substrátu
Parabolická povaha závislosti je vysvetlená skutočnosťou, že keď enzým interaguje so substrátom, vzniká komplex enzým-substrát. Spočiatku so zvýšením koncentrácie substrátu dochádza k zvýšeniu koncentrácie komplexov enzým-substrát v reakčnej zmesi, čo sa prejavuje paralelným zvýšením reakčnej rýchlosti. Pri určitej koncentrácii substrátu (nasýtenie) dochádza k určitému „nasýteniu“ všetkých aktívnych centier molekúl enzýmu v reakčnej zmesi. Rýchlosť enzymatickej reakcie pri nasýtenej koncentrácii sa stáva maximálnou. S ďalším nárastom obsahu substrátu v reakčnej zmesi sa nemení.
Z grafu závislosti rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu sa vypočítajú dva dôležité ukazovatele:
1. Maximálna rýchlosť reakcie (V. max). Je definovaná ako rýchlosť reakcie pri nasýtenej koncentrácii substrátu. Hodnota maximálnej rýchlosti odráža katalytickú silu enzýmu. Enzýmy s väčšou veľkosťou V. max sú výkonnejšie katalyzátory. Za jednotku času katalyzujú premenu viacerých molekúl substrátu. Hodnota maximálnej rýchlosti je vyjadrená počtom otáčok enzýmu. Počet otáčok je odhadovaný počtom molekúl substrátu premenených enzýmom za jednotku času (s -1). Pre väčšinu enzýmov je počet otáčok do 104. Súčasne existujú enzýmy, pre ktoré rýchlosť oveľa viac (600 000 - pre karboanhydrázu) alebo menej ako táto hodnota (100 - pre chymotrypsín).
2. Michaelisova konštanta (TO m). Michaelisova konštanta je koncentrácia substrátu, pri ktorej je reakčná rýchlosť polovica maxima. Množstvo TO m odráža afinitu enzýmu k substrátu. Čím väčšia je táto hodnota, tým menšiu afinitu k substrátu má enzým. TO m je vyjadrené v móloch substrátu. Takže množstvo TO m vo vzťahu k glukóze pre enzým glukokináza je 10 mmol a pre hexokinázu - 0,01 mmol. Hexokináza vykazuje väčšiu afinitu k glukóze ako glukokináza; pri rovnakej koncentrácii substrátu katalyzuje vyššiu rýchlosť fosforylácie glukózy.
Na základe matematickej analýzy krivky závislosti rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu odvodili L. Michaelis a M. Menten (1913) vzorec, ktorý umožňuje vyhodnotiť vzťah medzi reakčnou rýchlosťou , maximálna rýchlosť a Michaelisova konštanta. V súčasnosti je definovaná ako Michaelis-Mentenova rovnica.
V. o = V. max [ S]/K m + [ S],
kde V. o - rýchlosť reakcie, S- koncentrácia substrátu.
Všeobecné vlastnosti enzýmov
Napriek existencii určitých rozdielov v štruktúre, funkcii a intracelulárnej lokalizácii majú enzýmy niekoľko spoločných vlastností. Patrí sem závislosť prejavu ich katalytickej aktivity na teplote (tepelnej labilite) a pH média, ako aj na špecifickosti substrátu.
Charakteristickou vlastnosťou enzýmov je termolabilita... Tento jav je možné ilustrovať na grafe závislosti rýchlosti enzymatickej reakcie od teploty reakčnej zmesi (obr. 30).
Obrázok 30 - Závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od teploty
reakčné médium ( t opt - optimálna teplota; V.- rýchlostná reakcia)
Ako je zrejmé z predloženého grafu, pri teplote blízkej 4 ° C enzymatické reakcie prakticky neprebiehajú. Z tohto dôvodu môžu byť biologické objekty na určitý čas uskladnené pred vykonaním biochemických štúdií v chlade. Je to chlad, ktorý bráni jedlu v autolýze (vlastné trávenie).
Zvýšenie teploty je sprevádzané zvýšením rýchlosti enzymatickej reakcie. Dôvodom je zvýšenie kinetickej energie molekúl substrátu a enzýmu, čo zvyšuje rýchlosť interakcie medzi nimi. Podobný jav je pozorovaný až do teploty, ktorá zodpovedá teplotnému optimu enzýmu. Teplotné optimum enzýmu zodpovedá teplote, pri ktorej je rýchlosť enzymatickej reakcie maximálna. Pri enzýmoch teplokrvných zvierat je to zvyčajne 28 ° C alebo 37 ° C.
Ďalšie zvýšenie teploty reakčnej zmesi vedie k postupnému znižovaniu rýchlosti enzymatickej reakcie. Tento jav je spôsobený procesom tepelnej denaturácie reťazca proteínového polypeptidu. Denaturácia je sprevádzaná zmenou štruktúry aktívneho centra enzýmu, čo má za následok zníženie afinity enzýmu k substrátu. Pri teplotách nad 55 ° C väčšina enzýmov úplne stráca svoje katalytické vlastnosti (deaktivované). V tomto ohľade sa zahrievanie na 55 - 56 ° C široko používa na pasterizačné postupy, ktoré zvyšujú trvanlivosť potravinárskych výrobkov (mlieko atď.).
PH média má veľký vplyv na rýchlosť enzymatickej reakcie. Ako je zrejmé z diagramu zobrazeného na obr. 31 grafov, tvarom pripomína graf závislosti rýchlosti enzymatickej reakcie od teploty.
Obrázok 31 - Závislosť rýchlosti ( V.) enzymatická reakcia
na pH média (pH opt - optimum pH enzýmu)
Prudký pokles rýchlosti enzymatickej reakcie pri extrémnych hodnotách pH je spojený s fenoménom denaturácie polypeptidového reťazca molekuly proteínu pôsobením kyselín a zásad. Enzým vykazuje svoju maximálnu katalytickú silu pri hodnote pH, ktorá je definovaná týmto pojmom pH optimálne enzým. Väčšina známych enzýmov má optimum pH v rozmedzí 5,0 až 7,5. Súčasne existuje mnoho príkladov enzýmov, v ktorých je optimum pH posunuté smerom k kyslým alebo zásaditým hodnotám pH. Tieto enzýmy zahŕňajú:
Dôvod existencie závislosti rýchlosti enzymatických reakcií na pH je spojený so skutočnosťou, že pH média má výrazný vplyv na stupeň ionizácie funkčných skupín substrátu. Vlastnosti ionizácie molekuly kyseliny jantárovej pri rôznej kyslosti média (pH):
Hodnota pH média zároveň ovplyvňuje stupeň ionizácie aminokyselinových radikálov, ktoré tvoria aktívne centrum enzýmu:
Ak je tvorba komplexu enzým-substrát stabilizovaná elektrostatickými interakciami, potom sa objasní úloha pH pri poskytovaní optimálnych podmienok pre priebeh enzymatickej reakcie (obr. 24).
Rýchlosť reakcií katalyzovaných enzýmami, v ktorých interakcii so substrátmi nemajú významné hodnoty elektrostatické interakcie, je menej závislá od pH média. Na obr. 32 ukazuje závislosť rýchlosti hydrolýzy proteínov papaínom. Pri interakcii tohto enzýmu so substrátom majú prvoradý význam hydrofóbne interakcie. Ako je zrejmé z predloženého grafu, papaín nemá vôbec jasne vyjadrené optimum pH.
Obrázok 32 - Vplyv pH na rýchlosť hydrolýzy proteínov papaínom.
Enzýmy majú určité špecifickosť vo vzťahu k substrátom. Špecifickosť znamená vlastnosť enzýmov katalyzovať konverziu jedného alebo skupiny štruktúrne podobných substrátov. Existuje niekoľko typov enzýmovej špecifickosti.
· Absolútna špecifickosť. Vzťahuje sa na schopnosť enzýmu katalyzovať premenu iba jedného substrátu. K enzýmom s absolútnou špecifickosťou patrí argináza, restrikčná urikáza atď.
· Relatívna špecifickosť... Znamená to schopnosť enzýmu katalyzovať transformáciu skupiny štruktúrne podobných substrátov (takzvané proteolytické enzýmy hydrolyzujú rôzne proteíny, lipázové estery glycerolu a vyšších mastných kyselín, hexokináza fosforyluje rôzne monosacharidy). V tomto prípade je špecificita daná skutočnosťou, že enzým ovplyvňuje iba určitý typ väzby (proteolytické enzýmy hydrolyzujú peptidovú väzbu, lipáza hydrolyzuje esterovú väzbu atď.).
· Stereospecificita . Tento termín sa týka vlastnosti enzýmu katalyzovať premenu jedného stereoizoméru substrátu. Enzýmy zapojené do konverzie monosacharidov teda vykazujú špecifickosť vo vzťahu k svojim D-stereoizoméry a enzýmy podieľajúce sa na premene aminokyselín na ich L-stereoizoméry.
Enzýmová aktivita
Enzýmom ako katalyzátorom je, že sú pod vplyvom rôznych vonkajších faktorov schopné zmeniť svoje katalytické vlastnosti. Mierou prejavu sily katalytického účinku enzýmov je ich činnosť... Schopnosť enzýmov meniť svoju aktivitu za rôznych podmienok má veľký biologický význam. Táto vlastnosť umožňuje živej bunke prispôsobiť stav metabolických procesov momentálnym potrebám buniek, ktoré sa môžu výrazne meniť pod vplyvom rôznych vonkajších faktorov.
Pri ich charakterizácii hrá dôležitú úlohu stanovenie aktivity enzýmu. Existuje niekoľko všeobecných zásad na kvantifikáciu aktivity enzýmu. Aktivitu enzýmu je možné určiť nasledovne:
Alebo rýchlosťou akumulácie v reakčnej zmesi, kde sa nachádza enzým reakčného produktu;
Alebo rýchlosťou zmiznutia substrátu enzymatickej reakcie z reakčnej zmesi.
Oba tieto prístupy sú ekvivalentné a dajú sa použiť v praxi. Pri určovaní aktivity enzýmu je však potrebné dodržať nasledujúce podmienky: v reakčnej zmesi, v ktorej je aktivita enzýmu stanovená,
· Teplota by mala zodpovedať teplotnému optimu daného enzýmu;
· PH média by malo zodpovedať optimu pH daného enzýmu;
· Koncentrácia substrátu by nemala byť menšia ako nasýtená;
· Musia byť prítomné kofaktory, ak nejaký z týchto enzýmov existuje;
· Aktivátory enzýmov musia byť prítomné.
Aktivita enzýmu je teda stanovená za podmienok, ktoré sú pre ňu optimálne. Za týchto podmienok je aktivita enzýmu úmerná jeho obsahu v testovanej vzorke, a preto ho možno použiť na nepriamy odhad jeho koncentrácie.
Enzýmová aktivita je kvantitatívne vyjadrená v jednotky činnosti. Na jednu jednotku aktivity enzýmu (U) sa odoberie aktivita enzýmu, pri ktorej sa pod jeho vplyvom vytvorí 1 μmol reakčného produktu (alebo zmizne 1 μmol substrátu) za minútu. V systéme SI sa katal (kat) považuje za jednotku enzymatickej aktivity. 1 katal zodpovedá aktivite enzýmu, pri ktorej sa vytvorí jeden mol reakčného produktu (zmiznutie jedného molu substrátu) za sekundu.
Hodnota špecifickej aktivity sa tiež používa na charakterizáciu enzýmov. Táto jednotka odráža aktivitu enzýmu na jednotku jeho hmotnosti a je vyjadrená v μmol / min mg proteínu. Na stanovenie čistoty enzýmových prípravkov sa používajú jednotky špecifickej aktivity. Čím je hodnota špecifickej aktivity vyššia, tým je prípravok enzýmu čistejší.
Enzymatická kinetika študuje rýchlosť reakcií katalyzovaných enzýmami v závislosti od rôznych podmienok (koncentrácia, teplota, pH atď.) Ich interakcie so substrátom.
Enzýmy sú však bielkoviny, ktoré sú citlivé na vplyv rôznych vonkajších vplyvov. Preto sa pri štúdiu rýchlosti enzymatických reakcií berú do úvahy hlavne koncentrácie reagujúcich látok a pokúša sa minimalizovať vplyv teploty, pH média, aktivátorov, inhibítorov a ďalších faktorov a vytvárajú sa štandardné podmienky. Po prvé, je to hodnota pH média, ktorá je pre daný enzým optimálna. Za druhé, odporúča sa, pokiaľ je to možné, dodržiavať teplotu 25 ° C. Po tretie, dosiahne sa úplná saturácia enzýmu substrátom. Tento bod je obzvlášť dôležitý, pretože pri nízkej koncentrácii substrátu sa reakcie nezúčastňujú všetky molekuly enzýmu (obr. 6.5, a), čo znamená, že výsledok bude ďaleko od maximálneho možného. Najväčšia sila katalyzovanej reakcie, ak sú ostatné veci rovnaké, sa dosiahne, ak sa na premene zúčastňuje každá molekula enzýmu, t.j. pri vysokej koncentrácii komplexu enzým-substrát (obr. 6.5, v). Ak koncentrácia substrátu nezabezpečí úplné nasýtenie enzýmu (obr. 6.5, b), potom rýchlosť prebiehajúcej reakcie nedosiahne svoju maximálnu hodnotu.
Ryža. 65.
a - pri nízkej koncentrácii substrátu; 6 - s nedostatočnou koncentráciou substrátu; v - s úplným nasýtením enzýmu substrátom
Rýchlosť enzymatickej reakcie, meraná za uvedených podmienok, a úplné nasýtenie enzýmu substrátom sa nazýva maximálna rýchlosť enzymatickej reakcie (V).
Udáva sa rýchlosť enzymatickej reakcie, stanovená s neúplným nasýtením enzýmu substrátom v.
Enzymatickú katalýzu je možné zjednodušiť podľa nasledujúcej schémy
kde F je enzým; S - substrát; FS - komplex enzým -substrát.
Každá fáza tohto procesu sa vyznačuje určitou rýchlosťou. Jednotkou na meranie rýchlosti enzymatickej reakcie je počet mólov substrátu premeneného na jednotku času(ako aj rýchlosť normálnej reakcie).
Interakcia enzýmu so substrátom vedie k vytvoreniu komplexu enzým-substrát, ale tento proces je reverzibilný. Rýchlosti priamych a reverzných reakcií závisia od koncentrácií reagujúcich látok a sú popísané príslušnými rovnicami:
V stave rovnováhy platí rovnica (6,3), pretože rýchlosti reakcie vpred a vzad sú rovnaké.
Nahradením hodnôt rýchlosti reakcií vpred (6,1) a spätných (6,2) do rovnice (6,3) získame rovnosť:
Stav rovnováhy je charakterizovaný zodpovedajúcim rovnovážna konštanta K p, rovná pomeru konštánt reakcie vpred a vzad (6,5). Inverzná hodnota rovnovážnej konštanty sa nazýva substrátová konštanta K s, alebo disociačná konštanta komplexu enzým-substrát:
Z rovnice (6.6) je zrejmé, že konštanta substrátu klesá pri vysokej koncentrácii komplexu enzým-substrát, t.j. so svojou veľkou stabilitou. V dôsledku toho substrátová konštanta charakterizuje afinitu enzýmu a substrátu a pomer rýchlostných konštánt pre tvorbu a disociáciu komplexu enzým-substrát.
Fenomén nasýtenia enzýmu substrátom študovali Leonor Michaelis a Maud Mepten. Na základe matematického spracovania výsledkov odvodili rovnicu (6.7), ktorá získala ich názvy, z ktorých je zrejmé, že pri vysokej koncentrácii substrátu a nízkej hodnote konštanty substrátu je rýchlosť enzymatickej reakcie inklinuje k maximu. Táto rovnica je však obmedzená, pretože nezohľadňuje všetky parametre:
Komplex enzým-substrát počas reakcie môže prejsť transformáciou v rôznych smeroch:
- disociovať na východiskové materiály;
- premení na produkt, z ktorého sa enzým v nezmenenej forme oddelí.
Preto bol tento koncept predstavený na opis celkového pôsobenia enzymatického procesu Michaelisove konštanty K t,čo vyjadruje vzťah medzi rýchlostnými konštantami všetkých troch reakcií enzymatickej katalýzy (6.8). Ak sú obidva termíny delené rýchlostnou konštantou reakcie tvorby komplexu enzým-substrát, potom sa získa výraz (6.9):
Z rovnice (6.9) vyplýva dôležitý dôsledok: Michaelisova konštanta je vždy o hodnotu väčšia ako konštanta substrátu k 2 / k v
Číselne K t je koncentrácia substrátu, pri ktorej je reakčná rýchlosť polovičná oproti maximálnej možnej rýchlosti a zodpovedá saturácii enzýmu substrátom, ako je to na obr. 6,5, b. Pretože v praxi nie je vždy možné dosiahnuť úplné nasýtenie enzýmu substrátom, je to tak K t používa sa na porovnávaciu charakterizáciu kinetických charakteristík enzýmov.
Rýchlosť enzymatickej reakcie s neúplným nasýtením enzýmu substrátom (6.10) závisí od koncentrácie komplexu enzým-substrát. Koeficient proporcionality je reakčnou konštantou na uvoľnenie enzýmu a produktu, pretože sa tým zmení koncentrácia komplexu enzým-substrát:
Po transformáciách, berúc do úvahy vyššie uvedené závislosti, je rýchlosť enzymatickej reakcie s neúplným nasýtením enzýmu substrátom opísaná rovnicou (6.11), t.j. závisí od koncentrácie enzýmu, substrátu a ich afinity K s:
Grafická závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie od koncentrácie substrátu nie je lineárna. Ako je zrejmé z obr. 6,6, so zvýšením koncentrácie substrátu sa pozoruje zvýšenie aktivity enzýmu. Keď sa však dosiahne maximálna saturácia enzýmu substrátom, rýchlosť enzymatickej reakcie sa stane maximálnou. Faktorom obmedzujúcim reakčnú rýchlosť je preto tvorba komplexu enzým-substrát.
Prax ukázala, že koncentrácia substrátov je spravidla vyjadrená hodnotami oveľa menšími ako jednota (106 6 103 mol). Je dosť ťažké pracovať s takýmito hodnotami vo výpočtoch. G. Lineweaver a D. Burke preto navrhli vyjadriť grafickú závislosť rýchlosti enzymatickej reakcie nie v priamych súradniciach, ale naopak. Vychádzali z predpokladu, že pre rovnaké hodnoty sú ich inverzné hodnoty tiež rovnaké:
Ryža. 6.6.
Po transformácii expresie (6.13) sa získa výraz, tzv podľa rovnice Lineweaver - Burke (6.14):
Grafická závislosť rovnice Lineweaver-Burk je lineárna (obr. 6.7). Kinetické charakteristiky enzýmu sa určujú nasledovne:
- segment odrezaný na súradnici je rovný 1 / V;
- segment prerušený na osi x je -1 / K t.
Ryža. 6.7.
Verí sa, že metóda Lineweaver-Burke umožňuje presnejšie stanovenie maximálnej reakčnej rýchlosti ako v priamych súradniciach. Z tohto grafu je tiež možné získať cenné informácie o inhibícii enzýmov.
Existujú aj iné spôsoby, ako transformovať Michaelis-Mentenovu rovnicu. Grafické závislosti sa používajú na štúdium vplyvu rôznych vonkajších vplyvov na enzymatický proces.