ניתוח HPLC. כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC). ניתוח מתחמי קדמיום בסביבה

מאמר תרופתי כללי

במקום אמנות. GF XI

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (High Pression Liquid Chromatography) היא שיטת כרומטוגרפיה עמודה שבה הפאזה הניידת היא נוזל הנע בעמודה כרומטוגרפית מלאה בפאזה נייחת (סורבנט). עמודות כרומטוגרפיה נוזליות בעלות ביצועים גבוהים מאופיינות בירידה גבוהה בלחץ הכניסה.

בהתאם למנגנון ההפרדה של חומרים, נבדלות האפשרויות הבאות לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים: ספיחה, הפצה, חילופי יונים, אי הכללת גודל, כיראלית וכו' בהתאם לאופי האינטראקציות הבין-מולקולריות העיקריות המתבטאות. בכרומטוגרפיה ספיחה, הפרדת החומרים מתרחשת בשל יכולתם השונה לספוג ולספוג מפני השטח של סורבנט בעל משטח מפותח, למשל, סיליקה ג'ל. בכרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים בהפצה, ההפרדה מתרחשת עקב ההבדל במקדמי ההתפלגות של החומרים שיש להפריד בין הפאזות הנייחות (בדרך כלל מושתלות כימית על פני הספק הנייח) לבין הפאזות הניידות.

בהתאם לסוג הפאזות הניידות והנייחות, מבחינים בכרומטוגרפיה של פאזה רגילה ושל פאזה הפוכה. בכרומטוגרפיית נוזלים עם ביצועים גבוהים בשלב רגיל, השלב הנייח הוא קוטבי (לרוב סיליקה ג'ל או סיליקה ג'ל עם קבוצות NH 2 - או CN מושתלות וכו'), והפאזה הניידת אינה קוטבית (הקסאן, או תערובת של הקסאן עם ממיסים אורגניים קוטביים יותר - כלורופורם, אלכוהול וכו'). שימור החומרים עולה עם עלייה בקוטביות שלהם. בכרומטוגרפיה של פאזה רגילה, יכולת הפליטה של ​​הפאזה הנייד עולה עם עלייה בקוטביות שלו.

בכרומטוגרפיה הפוכה, השלב הנייח אינו קוטבי (ג'לי סיליקה הידרופוביים עם קבוצות C4, C8, C18 מושתלות וכו'); הפאזה הניידת היא קוטבית (תערובות של מים וממיסים קוטביים: אצטוניטריל, מתנול, טטרה-הידרופורן וכו'). שימור החומרים עולה עם עלייה בהידרופוביות שלהם (אי-קוטביות). ככל שתכולת הממס האורגני גבוהה יותר, כך יכולת הפליטה של ​​הפאזה הניידת גבוהה יותר.

בכרומטוגרפיה של חילופי יונים, המולקולות של חומרי התערובת, המפורקות בתמיסה לקטיונים ולאניונים, מופרדות כאשר עוברות דרך הסורבנט (קטיון או אניון) עקב בעוצמה משתנהאינטראקציות של היונים שייקבעו עם הקבוצות היוניות של הסורבנט.

בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (מסננת, חדירת ג'ל, סינון ג'ל), מולקולות של חומרים מופרדות לפי גודל בשל יכולתן השונה לחדור לתוך הנקבוביות של הפאזה הנייחת. במקרה זה, המולקולות הגדולות ביותר המסוגלות לחדור למספר המינימלי של נקבוביות השלב הנייח הן הראשונות לעזוב את העמוד, וחומרים בעלי גדלים מולקולריים קטנים הם האחרונים לעזוב.

כרומטוגרפיה כיראלית מפרידה תרכובות פעילות אופטית לאננטיומרים בודדים. ההפרדה יכולה להתבצע על פאזות נייחות כיראליות או על פאזות נייחות אכיראליות באמצעות פאזות ניידות כיראליות.

ישנן אפשרויות אחרות לכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים.

לעתים קרובות ההפרדה ממשיכה לא באחד, אלא בכמה מנגנונים בו זמנית, בהתאם לסוג השלבים הניידים והנייחים, כמו גם לאופי המתחם הנקבע.

אזור יישום

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים מיושמת בהצלחה הן לניתוח איכותני והן לניתוח כמותי תרופותבבדיקות "אותנטיות", "זיהומים", "פירוק", "אחידות מינון", "כימות". יש לציין כי כרומטוגרפיה מאפשרת לשלב מספר בדיקות בדגימה אחת, כולל "אותנטיות" ו"כימות".

צִיוּד

לצורך הניתוח השתמשו במכשירים המתאימים - כרומטוגרפים נוזליים.

ההרכב של כרומטוגרף נוזלי כולל בדרך כלל את המרכיבים העיקריים הבאים:

- יחידת הכנת פאזה ניידת, לרבות מיכל עם פאזה ניידת (או מיכלים עם ממיסים בודדים המהווים חלק מהפאזה הניידת) ומערכת שחרור פאזה ניידת;

- מערכת שאיבה;

- מערבל פאזה נייד (במידת הצורך);

- מערכת הקדמה לדוגמא (מזרק), יכולה להיות ידנית או אוטומטית (דגימה אוטומטית);

- עמודה כרומטוגרפית (ניתן להתקין בתרמוסטט);

- גלאי (אחד או יותר עם שיטות זיהוי שונות);

- מערכת בקרת כרומטוגרף, איסוף ועיבוד נתונים.

בנוסף, כרומטוגרף עשוי לכלול: מערכת הכנת דגימות וכור טרום-עמודה, מערכת מיתוג עמודות, כור לאחר-עמודה וציוד נוסף.

מערכת שאיבה

המשאבות מספקות את הפאזה הניידת לעמוד במהירות נתונה. הרכב הפאזה הנייד וקצב הזרימה יכולים להיות קבועים או להשתנות במהלך הניתוח. במקרה של הרכב קבוע של השלב הנייד, התהליך נקרא איזוקרטי, ובשני - שיפוע. מערכת שאיבת כרומטוגרף נוזלית מודרנית מורכבת ממשאבה אחת או יותר הנשלטת על ידי מחשב. זה מאפשר לשנות את הרכב השלב הנייד לפי תוכנית ספציפית במהלך פליטת שיפוע. משאבות לכרומטוגרפיית נוזלים אנליטית בביצועים גבוהים מאפשרות שמירה על קצב הזרימה של הפאזה הניידת לעמוד בטווח שבין 0.1 ל-10 מ"ל/דקה בלחץ בכניסת העמודה של עד 40 MPa. פעימות הלחץ ממוזערות על ידי מערכות שיכוך מיוחדות הכלולות בתכנון המשאבה. חלקי העבודה של המשאבות עשויים מחומרים עמידים בפני קורוזיה, המאפשרים שימוש ברכיבים אגרסיביים בשלב הנייד.

מיקסרים

במיקסר נוצר פאזה ניידת אחת מממסים נפרדים המסופקים על ידי משאבות, אם התערובת הנדרשת לא הוכנה מראש. ערבוב מרכיבי הפאזה הניידת במיקסר יכול להתרחש הן בלחץ נמוך (לפני המשאבות) והן בלחץ גבוה (אחרי המשאבות). ניתן להשתמש במיקסר להכנת פאזה ניידת ולפליטה איזוקרטית.

נפח המיקסר יכול להשפיע על זמן השמירה של הרכיבים בגלידת שיפוע.

מזרקים

המזרקים יכולים להיות אוניברסליים, עם יכולת לשנות את נפח הדגימה המוזרקת, או דיסקרטיים להזרקת דגימה בנפח מסוים בלבד. שני סוגי המזרקים יכולים להיות אוטומטיים ("מזרקים אוטומטיים" או "דוגמים אוטומטיים"). מזרק המדגם (תמיסה) ממוקם ישירות מול העמודה הכרומטוגרפית. עיצוב המזרק מאפשר לך לשנות את כיוון הזרימה של השלב הנייד ולבצע הזרקה ראשונית של הדגימה ללולאת מינון בנפח מסוים (בדרך כלל בין 10 ל-100 μL) או למכשיר מינון מיוחד בעל משתנה. כרך. גודל הלולאה מצוין על התווית שלו. עיצוב המזרק הדיסקרטי מאפשר בדרך כלל החלפת לולאה. מזרקים אוטומטיים מודרניים יכולים להיות מספר פונקציות נוספות, למשל, לבצע את הפונקציה של תחנת הכנת דגימות: לערבב ולדלל דגימות, לבצע תגובת נגזרת טרום-עמודה.

טור כרומטוגרפי

עמודות כרומטוגרפיות הן בדרך כלל צינורות נירוסטה, זכוכית או פלסטיק מלאים בחומר סופג וסגורים משני הצדדים על ידי מסננים בקוטר נקבוביות של 2-5 מיקרון. אורך העמודה האנליטית יכול להיות בטווח שבין 5 ל-60 ס"מ או יותר, והקוטר הפנימי הוא בין 2 ל-10 מ"מ. עמודות עם קוטר פנימי של פחות מ-2 מ"מ משמשות בכרומטוגרפיה של מיקרו-עמודות. ישנם גם עמודים נימיים בקוטר פנימי של כ-0.3–0.7 מ"מ. עמודות לכרומטוגרפיה הכנה יכולות להיות בקוטר פנימי של 50 מ"מ או יותר.

ניתן להתקין מול העמוד האנליטי עמודים קצרים (עמודי שמירה) המבצעים פונקציות עזר שונות, שהעיקרית שבהן היא הגנת העמוד האנליטי. בדרך כלל, הניתוח מתבצע בטמפרטורת החדר, עם זאת, כדי להגביר את יעילות ההפרדה ולהפחית את זמן הניתוח, ניתן להשתמש בתרמוסטט עמודה בטמפרטורות של עד 80 - 100 מעלות צלזיוס. האפשרות להשתמש בטמפרטורה מוגברת במהלך ההפרדה מוגבלת על ידי יציבות השלב הנייח, שכן ב טמפרטורות גבוהותהרס שלו אפשרי.

שלב נייח (סופח)

משמש בדרך כלל כחומרי ספיגה:

• סיליקה ג'ל, אלומינה, בשימוש בכרומטוגרפיה רגילה. מנגנון השמירה במקרה זה הוא בדרך כלל ספיחה;
• סיליקה ג'ל, שרפים או פולימרים המושתלים בקבוצות חומציות או בסיסיות. אזור יישום - חילופי יונים וכרומטוגרפיה של יונים;
• סיליקה ג'ל או פולימרים עם חלוקה נתונה של גדלי נקבוביות (כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל);
• סורבנטים שעברו שינוי כימי (סורבנטים עם שלבים מושתלים), המוכנים לרוב על בסיס סיליקה ג'ל. מנגנון השמירה הוא ספיחה או חלוקה בין השלב הנייד והנייח. ההיקף תלוי בסוג הקבוצות הפונקציונליות המושתלות. סוגים מסוימים של סופגים יכולים לשמש הן בכרומטוגרפיה הפוכה והן בכרומטוגרפיה רגילה;
• סורבנטים כיראליים שעברו שינוי כימי, למשל, נגזרות תאית ועמילוז, חלבונים ופפטידים, ציקלודקסטרינים, כיטוסנים המשמשים להפרדה של אננטיומרים (כרומטוגרפיה כיראלית).

לסופגים המושתלים יכולים להיות דרגות שונות של שינוי כימי. השלבים המושתלים הנפוצים ביותר הם:

- קבוצות אוקטדציל (סופח אוקטדצילסילאן (ODS) או C 18);

- קבוצות אוקטיל (אוקטילסילאן או סורבנט C 8);

- קבוצות פניל ​​(סופח פנילסילאן);

- קבוצות ציאנופרופיל (סופח CN);

- קבוצות אמינופרופיל (סופח NH 2);

- קבוצות דיול (דיול סורבנטי).

לרוב, הניתוח מבוצע על שלבים מושתלים לא קוטביים במצב הפוך באמצעות חומר סופג C 18.

סופחים עם שלבים מושתלים, המתקבלים על בסיס סיליקה ג'ל, יציבים מבחינה כימית בערכי pH בין 2.0 ל-7.0, אלא אם צוין אחרת במפורש על ידי היצרן. לחלקיקים סופגים יכולים להיות צורות כדוריות או לא סדירות ונקבוביות שונות. גודל החלקיקים של הסורבנט בכרומטוגרפיית נוזלים אנליטית גבוהה הוא בדרך כלל 3-10 מיקרומטר, בכרומטוגרפיית נוזלים ביצועים גבוהים הכנה - 50 מיקרומטר או יותר. ישנם גם עמודים מונוליטיים בהם הסורבנט הוא מונוליט בעל נקבוביות דרך הממלאות את כל נפח העמוד.

יעילות הפרדה גבוהה מובטחת על ידי שטח הפנים הגבוה של חלקיקי הסופג (שהיא תולדה של גודלם המיקרוסקופי ונוכחות הנקבוביות), כמו גם אחידות הרכב הסופג והאריזה הצפופה והאחידה שלו.

גלאים

שיטות זיהוי שונות משמשות בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. במקרה הכללי, הפאזה הניידת עם הרכיבים המומסים בה, לאחר העמודה הכרומטוגרפית, נכנסת לתא הגלאי, שם אחת או אחרת מתכונותיו (ספיגה באזור הספקטרלי האולטרה סגול או הנראה לעין, הקרינה, מקדם השבירה, מוליכות חשמלית, וכו') נמדדים ברציפות. הכרומטוגרמה המתקבלת היא גרף של התלות של פרמטר פיזי או פיזיקוכימי מסוים של השלב הנייד בזמן.

הגלאים הנפוצים ביותר בכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים הם ספקטרופוטומטריים. בתהליך של אלוציה של חומרים במיקרו-קוובטה שתוכננה במיוחד, הצפיפות האופטית של ה-eluate נמדדת באורך גל שנבחר מראש. הטווח הרחב של הליניאריות של הגלאי מאפשר לך לנתח הן זיהומים והן את המרכיבים העיקריים של התערובת על כרומטוגרמה אחת. הגלאי הספקטרופוטומטרי מאפשר זיהוי בכל אורך גל בטווח הפעולה שלו (ככלל, 190-600 ננומטר). כמו כן נעשה שימוש בגלאים מרובי אורכי גל המאפשרים זיהוי במספר אורכי גל בו זמנית ובגלאים על מערך דיודות, המאפשרים רישום צפיפות אופטית בו זמנית בכל טווח אורכי הגל ההפעלה (בדרך כלל 190-950 ננומטר). זה מאפשר לתעד את ספקטרום הקליטה של ​​הרכיבים העוברים בתא הגלאי.

גלאי פלואורסצנטי משמש לאיתור תרכובות ניאון או תרכובות לא פלואורסצנטיות בצורה של נגזרות הפלורסנט שלהן. עקרון הפעולה של גלאי פלואומטרי מבוסס על מדידת קרינת הפלורסנט של האור הנקלט. הקליטה מתבצעת בדרך כלל באזור האולטרה סגול של הספקטרום, אורכי הגל של הקרינה הפלורסנטית עולים על אורכי הגל של האור הנקלט. לגלאים פלואורומטריים רגישות וסלקטיביות גבוהה מאוד. הרגישות של גלאי פלורסנט גבוהה פי 1000 בערך מהרגישות של ספקטרופוטומטריים. גלאי הקרינה המודרניים מאפשרים לא רק קבלת כרומטוגרמות, אלא גם רישום ספקטרום העירור והקרינה של התרכובות המנותחות.

כדי לקבוע תרכובות הנספגות בצורה חלשה באזורים האולטרה סגולים והנראה לעין של הספקטרום (לדוגמה, פחמימות), השתמש רפרקטומטריגלאים (רפרקטומטרים). החסרונות של גלאים אלו הם רגישותם הנמוכה (בהשוואה לגלאים ספקטרופוטומטריים) ותלות משמעותית בטמפרטורה של עוצמת האות (הגלאי חייב להיות בטרמוסטט), כמו גם חוסר האפשרות להשתמש בהם במצב פליטת שיפוע.

עקרון הפעולה גלאי פיזור אור לייזר אידוימבוסס על ההבדל בין לחצי האדים של הממסים הכרומטוגרפיים הכלולים בשלב הנייד לבין החומרים המנותחים. ביציאת העמוד, הפאזה הניידת מוכנסת לתוך נבולייזר, מעורבב עם חנקן או CO 2, ובצורת אירוסול עדין נכנס לצינור מאייד מחומם בטמפרטורה של 30 - 160 מעלות צלזיוס, שבו הנייד השלב מתאדה. אירוסול של חלקיקי אנליט לא נדיפים מפזר את שטף האור בתא הדיפוזיה. לפי מידת הפיזור של שטף האור, ניתן לשפוט את כמות התרכובת שנקבעה. הגלאי רגיש יותר מזה הרפרקטומטרי, האות שלו אינו תלוי בתכונות האופטיות של הדגימה, בסוג הקבוצות הפונקציונליות בחומרים שנקבעו, בהרכב הפאזה הניידת וניתן להשתמש בו במצב פליטת שיפוע .

גלאים אלקטרוכימיים (מוליכים, אמפרומטריים, קולומטריים וכו'). גלאי אמפרומטרי משמש לזיהוי תרכובות אלקטרואקטיביות שניתן לחמצן או להפחית על פני אלקטרודה מוצקה. האות האנליטי הוא גודל זרם החמצון או ההפחתה. לתא הגלאי יש לפחות שתי אלקטרודות - אחת עובדת ואלקטרודת ייחוס (כלוריד כסף או פלדה). פוטנציאל עבודה מופעל על האלקטרודות, שערכו תלוי באופי התרכובות הנקבעות. מדידות יכולות להתבצע הן בפוטנציאל קבוע והן במצב דופק, כאשר פרופיל השינוי בפוטנציאל של האלקטרודה הפועלת נקבע במהלך מחזור אחד של רישום האות. הגלאי האמפומטרי משתמש באלקטרודות עובדות העשויות מחומרי פחמן (לרוב פחמן מזכוכית או גרפיט), ומתכת: פלטינה, זהב, נחושת, ניקל.

גלאי מולטומטרי משמש לזיהוי אניונים וקטיונים בכרומטוגרפיה של יונים. עקרון הפעולה שלו מבוסס על מדידת המוליכות החשמלית של הפאזה הניידת בתהליך הפליטה של ​​החומר.

הגלאי ספקטרומטרי מסה, בעל רגישות וסלקטיביות גבוהים, אינפורמטיבי ביותר. הדגמים העדכניים ביותר של ספקטרומטרי מסה לכרומטוגרפיה נוזלית פועלים בטווח המסה m/z בין 20 ל-4000 אמו.

בכרומטוגרפיה נוזלית עם ביצועים גבוהים, משתמשים גם בגלאי פורייה-IR, רדיואקטיביות ועוד כמה אחרים.

מערכת איסוף ועיבוד נתונים

מערכת מודרנית לעיבוד נתונים היא מחשב אישי המחובר לכרומטוגרף עם תוכנה מותקנת המאפשרת רישום ועיבוד הכרומטוגרמה וכן בקרה על פעולת הכרומטוגרף וניטור הפרמטרים העיקריים של המערכת הכרומטוגרפית.

שלב נייד

הפאזה הניידת בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים מבצעת פונקציה כפולה: היא מספקת העברת מולקולות נספגות לאורך העמוד ומווסתת את קבועי שיווי המשקל, וכתוצאה מכך, שימור כתוצאה מאינטראקציה עם השלב הנייח (נספג על פני השטח) עם המולקולות של החומרים שיש להפריד. לפיכך, על ידי שינוי הרכב הפאזה הניידת בכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים, ניתן להשפיע על זמני השמירה של תרכובות, על הסלקטיביות והיעילות של ההפרדה שלהן.

השלב הנייד יכול להיות מורכב מממס אחד, לעתים קרובות שניים, במידת הצורך שלושה או יותר. הרכב השלב הנייד מצוין כיחס הנפח של הממיסים הכלולים בו. במקרים מסוימים, ניתן לציין את יחס המסה, אשר יש לציין במיוחד. כמרכיבים של הפאזה הניידת, ניתן להשתמש בתמיסות חיץ בעלות ערך pH מסוים, מלחים שונים, חומצות ובסיסים ומדיפיקטורים אחרים.

כרומטוגרפיה של פאזה רגילה משתמשת בדרך כלל בפחמימנים נוזליים (הקסאן, ציקלוהקסאן, הפטאן) וממיסים אחרים יחסית לא קוטביים עם תוספות קטנות של תרכובות אורגניות קוטביות השולטות בחוזק הפליטה של ​​הפאזה הניידת.

בכרומטוגרפיה הפוכה של פאזה, מים או תערובות מימיות-אורגניות משמשות כשלב הנייד. תוספים אורגניים הם בדרך כלל ממיסים אורגניים קוטביים (אצטוניטריל ומתנול). כדי לייעל את ההפרדה, ניתן להשתמש בתמיסות מימיות בעלות ערך pH מסוים, בפרט בתמיסת חוצץ, וכן בתוספים שונים לשלב הנייד: חומצות זרחתיות ואצטית בהפרדה של תרכובות חומציות; אמוניה ואמינים אליפטים בהפרדה של תרכובות בסיסיות, ומשתנים אחרים.

ניתוח כרומטוגרפי מושפע מאוד מטוהר הפאזה הניידת; לכן, עדיף להשתמש בממסים המיוצרים במיוחד עבור כרומטוגרפיה נוזלית (כולל מים).

בעת שימוש בגלאי ספקטרופוטומטרי UV, הפאזה הניידת לא צריכה להיות בעלת ספיגה בולטת באורך הגל שנבחר לזיהוי. מגבלת השקיפות או הצפיפות האופטית באורך גל מסוים של ממס של יצרן מסוים מצוינת לעתים קרובות על האריזה.

השלב הנייד והתמיסות המנותחות לא אמורים להכיל חלקיקים לא מומסים ובועות גז. מים המתקבלים בתנאי מעבדה, תמיסות מימיות, ממיסים אורגניים המעורבבים מראש עם מים, כמו גם תמיסות מנותחות חייבים להיות נתונים לסינון עדין ולסילוק גז. למטרות אלו, נעשה בדרך כלל שימוש בסינון תחת ואקום דרך מסנן ממברנה עם גודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר אינרטי ביחס לממס או לתמיסה.

רשימה של תנאים כרומטוגרפיים שיש לציין

מונוגרף הפרמקופאה צריך להכיל: השם המסחרי המלא של העמודה עם ציון היצרן ומספר הקטלוג, מידות העמודה (אורך וקוטר פנימי), סוג הסורבנט עם ציון גודל החלקיקים, גודל הנקבוביות, טמפרטורת העמודה (אם יש צורך בתרמוסטטיות). ), נפח הדגימה המוזרקת (לולאות נפח), הרכב השלב הנייד ושיטת הכנתו, קצב ההזנה של השלב הנייד, סוג הגלאי ותנאי הגילוי (במידת הצורך, הפרמטרים של הגלאי בשימוש תא), תיאור מצב השיפוע (אם נעשה בו שימוש), כולל שלב האיזון מחדש לתנאים ההתחלתיים, זמן הכרומטוגרפיה, תיאור מפורטשיטות חישוב ונוסחאות, תיאורי הכנת פתרונות תקן ובדיקה.

אם נעשה שימוש בגזרת קדם-עמודות בדגימה האוטומטית, מסופק מידע על תוכנית הדגימה האוטומטית. במקרה של שימוש בגזירה לאחר עמודה, מצוין קצב ההזנה של מגיב הנגזרת, נפח לולאת הערבוב והטמפרטורה שלה.

סוגים שונים של כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים

כרומטוגרפיה של זוג יונים

אחד מהזנים של כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים ב-Reversed Phase הוא כרומטוגרפיה של זוג יונים - המאפשרת קביעת תרכובות מיוננות. לשם כך, תרכובות אורגניות הידרופוביות עם קבוצות יוניות (ריאגנטים של זוג יונים) מתווספות להרכב הכרומטוגרפיה המסורתית הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים של השלב הנייד. להפרדה של בסיסים משתמשים בדרך כלל בסולפטים של נתרן אלקיל, להפרדת חומצות משתמשים במלחי טטרה-אלקיל-אמוניום (פוספט טטרה-בוטיל-למוניום, צטיל-טרימתיל-אמוניום וכו'). במצב צמד יונים, הסלקטיביות של ההפרדה של רכיבים לא-יוניים תוגבל על ידי מנגנון שימור הפאזה ההפוכה, ושימור הבסיסים והחומצות יגדל באופן ניכר, בעוד שצורת הפסגות הכרומטוגרפיות תשתפר.

הכליאה במצב זוג יונים נובעת מתהליכי שיווי משקל מורכבים למדי המתחרים זה בזה. מצד אחד, עקב אינטראקציות הידרופוביות והשפעת העקירה של המדיום הקוטבי של הפאזה הניידת, ספיגה של יונים הידרופוביים על פני השטח של סיליקה ג'ל אלקיל מתאפשרת באופן שהקבוצות הטעונות פונות לפאזה הניידת. . במקרה זה, פני השטח רוכשים תכונות של חילופי יונים, והשמירה מצייתת לחוקי הכרומטוגרפיה של חילופי יונים. מאידך, תיתכן היווצרות של זוג יונים ישירות בנפח ה-eluent, ולאחר מכן ספיגה שלו על ה-sorption לפי מנגנון הפוך פאזה.

כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופלית ( HILIC כרומטוגרפיה)

כרומטוגרפיה של אינטראקציה הידרופלית משמשת להפרדת תרכובות קוטביות שנשמרות בצורה חלשה בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים הפוכה. כשלב נייד בגרסה זו של כרומטוגרפיה, נעשה שימוש בתערובות מים-אצטוניטריל בתוספת מלחים, חומצות או בסיסים. שלבים נייחים, ככלל, הם ג'לי סיליקה ששונו עם קבוצות קוטביות (אמינו, דיול, קבוצות ציאנופרופיל וכו'). ככל שהחיבורים הקוטביים יותר מוחזקים חזק יותר. יכולת הפליטה של ​​הפאזה הניידת עולה עם הגדלת הקוטביות.

חילופי יונים וכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים יוניים

כרומטוגרפיה של חילופי יונים משמשת לניתוח הן של תרכובות אורגניות (הטרוציקליות, חומצות אמינו, חלבונים וכו') והן אורגניות (קטיונים ואניונים שונים). ההפרדה של מרכיבי התערובת המנותחת בכרומטוגרפיה של חילופי יונים מבוססת על אינטראקציה הפיכה של יונים של החומרים המנותחים עם קבוצות חילופי היונים של הסורבנט. סורבנטים אלה הם בעיקר שרפים פולימריים לחילופי יונים (בדרך כלל קופולימרים של סטירן ודיוויניל-בנזן עם קבוצות חילופי יונים מושתלות), או ג'לי סיליקה עם קבוצות חילופי יונים מושתלות. סורבנטים עם קבוצות: -NH 3 +, -R 3 N +, -R 2 HN +, -RH 2 N + וכו' משמשים להפרדת אניונים (אניוניטים), וחומרים סופחים עם קבוצות: -SO 3 -, -RSO 3 -, - COOH, -PО 3 - ואחרים להפרדת קטיונים (מחליפי קטונים).

תמיסות מימיות של חומצות, בסיסים ומלחים משמשות כפאזה ניידת בכרומטוגרפיה של חילופי יונים. בדרך כלל, פתרונות חיץ משמשים כדי לשמור על ערכי pH מסוימים. אפשר גם להשתמש בתוספים קטנים של ממיסים אורגניים הניתנים לערבב במים - אצטוניטריל, מתנול, אתנול, טטרהידרופורן.

כרומטוגרפיה של יונים - גרסה של כרומטוגרפיה של חילופי יונים, שבה נעשה שימוש בגלאי מוליך לזיהוי התרכובות (יונים) שייקבעו. לקביעה רגישה ביותר של שינויים במוליכות של הפאזה הניידת העוברת דרך הגלאי, מוליכות הרקע של הפאזה הניידת חייבת להיות נמוכה.

ישנן שתי אפשרויות עיקריות לכרומטוגרפיית יונים.

הראשון שבהם - כרומטוגרפיה של יונים דו-עמודים, מבוסס על דיכוי המוליכות החשמלית של האלקטרוליט של הפאזה הניידת באמצעות עמודת חילופי יונים שנייה או מערכת דיכוי ממברנה מיוחדת הממוקמת בין העמוד האנליטי לגלאי. כאשר עוברים דרך המערכת, המוליכות של השלב הנייד יורדת.

האפשרות השנייה לכרומטוגרפיית יונים היא כרומטוגרפיית יונים בעמודה אחת. גרסה זו משתמשת בפאזה ניידת עם מוליכות חשמלית נמוכה מאוד. חומצות אורגניות חלשות נמצאות בשימוש נרחב כאלקטרוליטים: בנזואי, סליצילית או איזופטלית.

אי הכללת גודל כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (כרומטוגרפיה ג'ל) היא גרסה מיוחדת של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים המבוססת על הפרדת מולקולות לפי גודלן. התפלגות המולקולות בין השלב הנייח והנייד מבוססת על גודל המולקולות ובחלקה על צורתן וקוטביותן.

שני סוגים מגבילים של אינטראקציה של מולקולות עם שלב נייח נקבובי אפשריים. מולקולות גדולות מקוטר הנקבוביות המרבי אינן נשמרות כלל והן נפלטות ראשונות, ונעות במקביל לשלב הנייד. מולקולות בגדלים קטנים מקוטר הנקבוביות המינימלי של הסורבנט חודרות בחופשיות לנקבוביות והן האחרונות שנפלטות מהעמודה. שאר המולקולות בעלות גודל ביניים נשמרות בחלקן בנקבוביות ובמהלך האלוציה מופרדות לשברים בהתאם לגדלים שלהן ובחלקן לפי צורתן חודרות לנקבוביות הסורבנט בהתאם לגודלן ובחלקן בהתאם לגודלן. צוּרָה. כתוצאה מכך, חומרים נפלטים עם זמני החזקה שונים.

כרומטוגרפיה של אי הכללת יונים

מנגנון הכרומטוגרפיה של אי הכללת יונים מבוסס על ההשפעה שתרכובות בצורה מיוננת אינן נשמרות על מחליף יונים סורבנטי, בעוד תרכובות בצורה מולקולרית מתפזרות בין הפאזות הנייחות והמימיות בתוך הנקבוביות של סופח מחליף היונים. והפאזה הניידת הנודדת בחלל שבין חלקיקי הסופגים. ההפרדה מבוססת על דחייה אלקטרוסטטית, אינטראקציות קוטביות והידרופוביות בין תרכובות מומסות לסופג.

קבוצות אניוניות על פני הסורבנט פועלות כ"ממברנה" חדירה למחצה בין השלב הנייח והנייד. רכיבים טעונים שליליים אינם מגיעים לשלב הנייד הנייח, מכיוון שהם נדחים על ידי קבוצות פונקציונליות טעונות דומה ונפלטים בנפח ה"מת" (החופשי) של העמוד. רכיבים בצורה מולקולרית אינם "נדחים" על ידי הסורבנט לחילופי קטונים והם מופצים בין השלב הנייח והנייד. ההבדל במידת השמירה של רכיבים לא-יוניים של התערובת מוכתב על ידי שילוב של אינטראקציות קוטביות של רכיבים לא-יוניים עם קבוצות פונקציונליות של סופג מחליף קטונים ואינטראקציות הידרופוביות של רכיבים לא-יוניים עם הלא-קוטבי מטריצה ​​של הסורבנט.

כרומטוגרפיה כיראלית

מטרת הכרומטוגרפיה הכיראלית היא הפרדת איזומרים אופטיים. ההפרדה מתבצעת על שלבים נייחים כיראליים או על פאזות נייחות אכיראליות קונבנציונליות באמצעות פאזות ניידות כיראליות. סורבנטים בעלי משטח שונה על ידי קבוצות או חומרים בעלי מרכזים כיראליים (כיטוסנים, ציקלודקסטרינים, פוליסכרידים, חלבונים וכו' (סלקטורים כיראליים) משמשים כשלבים נייחים כיראליים. במקרה זה, ניתן להשתמש באותם פאזות כפאזות ניידות כמו ברגיל. כרומטוגרפיה פאזה או הפוך פאזה כאשר נעשה שימוש בשלבים נייחים אכיריים כדי להבטיח הפרדה של אננטיומרים, מתווספים מתקנים כיראליים לשלבים הניידים: קומפלקסים מתכת כיראליים, ליגנדים כיראליים ניטרליים, ריאגנטים כיראליים של זוג יונים וכו'.

Ultra Performance Liquid Chromatography

כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים היא גרסה של כרומטוגרפיית נוזלים יעילה יותר מכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים קלאסית.

תכונה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים היא השימוש בחומרים סופחים בגודל חלקיקים של 1.5 עד 2 מיקרון. העמודות הכרומטוגרפיות הן בדרך כלל באורך של 50 עד 150 מ"מ ובקוטר של 1 עד 4 מ"מ. נפח המדגם המוזרק יכול להיות מ-1 עד 50 μl. השימוש בעמודות כרומטוגרפיות כאלה יכול להפחית משמעותית את זמן הניתוח ולהגביר את יעילות ההפרדה הכרומטוגרפית. עם זאת, במקרה זה, הלחץ על העמוד יכול להגיע ל-80 - 120 MPa, התדירות הנדרשת של איסוף נתוני הגלאי יכולה לעלות עד 40-100 הרץ, יש למזער את נפח העמודות החוץ של המערכת הכרומטוגרפית. ציוד ועמודות כרומטוגרפיה המשמשים בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים מותאמים במיוחד כדי לעמוד בדרישות של סוג זה של כרומטוגרפיה.

ציוד המיועד לכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים יכול לשמש גם בגרסה הקלאסית של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים.

כרומטוגרפיית נוזלים

כרומטוגרפיית נוזליםהוא סוג של כרומטוגרפיה שבה שלב נייד, הנקרא eluent, הוא נוזל. שלב נייחאולי סופג מוצק, מנשא מוצק עם נוזל מוחל על פני השטח שלואוֹ לְהַגלִיד.

לְהַבחִין עמודיםו שכבה דקהכרומטוגרפיה נוזלית. בגרסת העמודים, חלק מתערובת החומרים להפרדה מועבר דרך עמודה מלאה בפאזה נייחת בזרם eluent הנעה בלחץ או בפעולת הכבידה. בכרומטוגרפיה של שכבה דקה, חומר הנפילה נע תחת פעולת כוחות נימיים לאורך שכבת ספיגה שטוחה המונחת על לוח זכוכית או נייר כסף, לאורך סרט פולימר נקבובי או לאורך רצועה של נייר כרומטוגרפי מיוחד. כמו כן, פותחה שיטה של ​​כרומטוגרפיה נוזלית בשכבה דקה בלחץ, כאשר חומר ההפלה נשאב דרך שכבת ספיגה הממוקמת בין הלוחות.

ישנם סוגים כאלה של כרומטוגרפיה נוזלית כמו אנליטיים(לניתוח תערובות חומרים) ו הכנה(לבודד רכיבים טהורים).

לְהַבחִין כרומטוגרפיה נוזלית (LC)בגרסתו הקלאסית, בוצע ב לחץ אטמוספרי, ו מהירות גבוהה) בוצע ב לחץ דם גבוה... כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) משתמשת בעמודות בקוטר של עד 5 מ"מ, ארוזות בחוזקה עם חומר סופג עם חלקיקים קטנים (3-10 מיקרון). כדי לשאוב את הבורר דרך העמוד, הפעילו לחץ של עד 3.107 Pa. סוג זה של כרומטוגרפיה נקרא כרומטוגרפיה בלחץ גבוה... העברת הבורר דרך העמוד בלחץ גבוה מאפשרת להגדיל באופן דרמטי את קצב הניתוח ולהגדיל משמעותית את יעילות ההפרדה עקב שימוש בחומר סופח מפוזר דק.

אפשרויות HPLCהם כרומטוגרפיה של מיקרו-עמודותעל עמודים בקוטר קטן מלאים סורבנט ו כרומטוגרפיה קפילריתעל עמודים נימיים חלולים ומלאי ספיגה. שיטת HPLC מאפשרת כיום לבודד, כמותית ואיכותית תערובות מורכבות של תרכובות אורגניות.

כרומטוגרפיה נוזלית היא שיטת המחקר הפיזיקוכימית החשובה ביותר בכימיה, ביולוגיה, ביוכימיה, רפואה וביוטכנולוגיה. הוא משמש עבור:

חקר תהליכים מטבוליים באורגניזמים חיים סמים;

· אבחון ברפואה;

· ניתוח מוצרים של סינתזה כימית ופטרוכימית, תוצרי ביניים, צבעים, דלקים, חומרי סיכה, שמן, שפכים;

· חקר איזותרמיות של ספיגה מתמיסה, קינטיקה וסלקטיביות של תהליכים כימיים;

פְּרִיקָה

· ניתוח והפרדה של תערובות, טיהורן ובידוד של חומרים ביולוגיים רבים מהן, כגון חומצות אמינו, חלבונים, אנזימים, וירוסים, חומצות גרעין, פחמימות, שומנים, הורמונים.

בכימיה של תרכובות מקרו-מולקולריות ובייצור פולימרים, איכות המונומרים מנותחת באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, נלמדת התפלגות המשקל המולקולרית והתפלגות לפי סוגי הפונקציונליות של אוליגומרים ופולימרים, הנחוצה לבקרת המוצר.

כרומטוגרפיה נוזלית משמשת גם בבשמים, תעשיית המזון, לניתוח זיהום סביבתי, במדע משפטי.

השיטה של ​​כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC) פותחה והוצגה באמצע שנות ה-70 של המאה העשרים. ואז הופיעו הכרומטוגרפים הנוזליים הראשונים.

כרומטוגרפיה נוזלית היא השיטה האופטימלית לניתוח של מולקולות לא יציבות מבחינה כימית ותרמית, חומרים בעלי מולקולריות גבוהה עם נדיפות מופחתת. ניתן להסביר זאת על ידי התפקיד המיוחד של הפאזה הניידת ב-LC, בניגוד לכרומטוגרפיה של גז: ה-eluent מבצע לא רק תפקיד הובלה.

2. מושגי יסוד וסיווג שיטות כרומטוגרפיה נוזליות.

על ידי מנגנון השמירה של החומרים המופרדים על ידי השלב הנייח LCלהבחין בין:

כרומטוגרפיה של משקעיםמבוסס על מסיסות שונה של משקעים שנוצרים כאשר מרכיבי התערובת המנותחת מקיימים אינטראקציה עם המשקע. היתרון של השיטה הוא שלאזורים המתקבלים לאורך הסורבנט יש גבולות חדים, מכילים משקעים של חומר אחד בלבד, ולעיתים מופרדים על ידי אזורים של סורבנט טהור. עם זאת, שיטה זו עדיין לא מצאה שימוש נרחב.

· כרומטוגרפיה של ספיחה , בהם ההפרדה מתבצעת כתוצאה מאינטראקציה של החומר איתו יש להפריד סופחכגון תחמוצת אלומיניום או סיליקה ג'ל, שיש על פני השטח מרכזי קוטב פעילים. מֵמֵס(פלט) - נוזל לא קוטבי.

אורז. תכנית הפרדה של תערובת חומרים באמצעות כרומטוגרפיה של ספיחה

http://www. xumuk. ru / biologhim / bio / img014.jpg

מנגנון הספיחה מורכב מאינטראקציה ספציפית בין פני השטח הקוטביים של הסורבנט לבין האזורים הקוטביים (או בעלי יכולת הקיטוב) של המולקולות של הרכיב המנותח (איור). אינטראקציה מתרחשת עקב אינטראקציה של תורם-מקבל או היווצרות של קשרי מימן.

אורז. דיאגרמת כרומטוגרפיית נוזל ספיחה

https://pandia.ru/text/80/271/images/image006_11.jpg "width =" 219 "height =" 200 ">

אורז. ... כרומטוגרפיה של מחיצת פאזה מושתלת (וריאנט פאזה רגיל).

http://www. chemnet. ru / rus / הוראה / שמן / spezprakt-chr. html

בְּ שלב רגילבגרסה של כרומטוגרפיית נוזל מחיצה, אלקילכלורוסילאנים מוחלפים המכילים קבוצות קוטביות, כגון ניטריל, קבוצות אמינו וכו', משמשים כמשנים של משטח סיליקה ג'ל (שלבים מושתלים) (איור). השימוש בפאזות מושתלות מאפשר לשלוט עדין בתכונות הספיחה של משטח הפאזה הנייחת ולהשיג יעילות הפרדה גבוהה.

שלב הפוךכרומטוגרפיה נוזלית מבוססת על התפלגות מרכיבי התערובת בין הפולאר הקוטבי לקבוצות לא קוטביות (שרשרות אלקיל ארוכות) המושתלות על פני השטח הסופג (איור). פחות נפוץ, גרסה של כרומטוגרפיה נוזלית עם פאזות נתמכות משמשת, כאשר שלב נייח נוזלי מוחל על תומך נייח.

אורז. ... כרומטוגרפיה של מחיצת פאזה מושתלת (גרסת פאזה הפוכה). http://www. chemnet. ru / rus / הוראה / שמן / spezprakt-chr. html

כרומטוגרפיית נוזל מחיצה כוללת נוזל מיצוי כרומטוגרפיה, שבו השלב הנייח הוא חומר מיצוי אורגני המופקד על נשא מוצק, והפאזה הניידת היא תמיסה מימית של התרכובות שיש להפריד. כמחלצים השתמשו, למשל, בפנולים, טריאלקיל פוספטים, אמינים, בסיסי אמוניום רבעוניים, כמו גם תרכובות אורגניות זרחניות המכילות גופרית. כרומטוגרפיית נוזל מיצוי משמשת להפרדה וריכוז של תרכובות אנאורגניות, למשל, יוני מתכת אלקלית, אקטינידים ואלמנטים אחרים בעלי תכונות דומות, בעיבוד דלק גרעיני מושקע.

כרומטוגרפיה של חילופי יונים,המבוסס על החלפה סטוכיומטרית הפיכה של יונים הכלול בתמיסה המנותחת עבור יונים ניידים הכלולים ב- מחליפי יונים.בהתאם לסימן המטען של הקבוצות המייננות, מחליפי יונים מחולקים ל מחליפי קטוניםו אניוניטים.יש גם מחליפי יונים אמפוטרים –אמפוליטים, שיכול להחליף בו זמנית גם קטיונים וגם אניונים. כרומטוגרפיה של חילופי יונים משמשת רק להפרדה של חלקיקים טעונים. ההפרדה מבוססת על היכולת של שרף מחליף יונים להחזיק יונים שונים בעלי חוזק שונה. יוניטמורכב ממטריקס פולימרי וקבוצות פעילות קשורות המסוגלות להחליף יונים. מחליף קטוניםבעל מאפיינים חומציים או מעט חומציים, שכן הוא כולל קבוצות: - SO3H, -CH2SO3H, - COOH, - PO3H2 ואחרים, שבהם יוני מימן ניידים. אניוניטיםבעלי תכונות בסיסיות או בסיסיות חלשות ומכילות קבוצות: = NH2, - NH2, -NR3 +, - OH ואחרים. ההפרדה של יונים מבוקרת על ידי בחירת ערכי ה-pH האופטימליים של חומר הניקוי וחוזק היוני שלו. חילופי יונים יכולים להיות מיוצגים באופן סכמטי על ידי תגובות:

R-H + Na + + Cl - → R-Na + H + + Cl - (חילופי קטונים)

R-OH + Na + + Сl - → R-Сl + Na + + OH - (חילופי אניונים)

מחליפי יונים חייבים לעמוד בדרישות הבאות: להיות יציבים כימית בסביבות שונות, חזקים מכנית במצב יבש ובעיקר במצב נפוח, בעלי יכולת ספיגה גבוהה ויכולת להתחדש היטב.

בכרומטוגרפיה של חילופי יונים (יונים), אניונים (קטיונים) מופרדים מתגלים כחומצות (בסיסים תואמים) עם גלאי מוליך רגיש במיוחד, כאשר עמודות בעלות ביצועים גבוהים ממולאים במחליף יונים פעיל על פני השטח עם קיבולת קטנה.

כרומטוגרפיה של זוג יונים, אשר יכול להיחשב כשילוב של ספיחה וכרומטוגרפיה של חילופי יונים. השיטה מבוססת על מיצוי של חומרים יוניים - העברתם מהפאזה המימית לפאזה האורגנית בצורה של זוגות יוניים. לשם כך, נוסף יון נגדי לשלב הנייד, המסוגל להגיב באופן סלקטיבי עם הרכיבים המנותחים, להמיר אותם ל תרכובות מורכבותעם היווצרות זוג יוני. היתרונות העיקריים של אפשרות זו הם שניתן לנתח חומרים חומציים, בסיסיים ונייטרליים בו זמנית.

כרומטוגרפיה של חילופי ליגנדיםמבוסס על יכולת שונה של התרכובות המופרדות ליצור קומפלקסים עם קטיוני מתכת מעבר- Cu + 2, Ni + 2, Zn + 2, Cd + 2, Co + 2 וכו' - וקבוצות קיבוע (ליגנדות) של השלב הנייח. חלק מתחום התיאום של יוני מתכת תפוס על ידי מולקולות מים או ליגנדים חלשים אחרים, אותם ניתן לעקור על ידי מולקולות התרכובות המופרדות. סוג זה של כרומטוגרפיה משמש להפרדת איזומרים אופטיים.

כרומטוגרפיה הדרת גודל(מסננת, חודרת ג'ל, סינון ג'ל), שבה מבוססת ההפרדה הבדלים בגודל מולקולרי.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image009_7.jpg "align =" right "width =" 429 "height =" 319 ">

אורז. תכנית כרומטוגרפיה של ג'ל

כרומטוגרפיה(ביוספציפי), בהתבסס על העובדה שמקרומולקולות פעילות ביולוגית רבות, למשל, אנזימים, יכולות להיקשר ספציפית למגיב מסוים. המגיב מקובע על מנשא (לעתים קרובות agarose), ואז נשטף עם התערובת המנותחת. רק המקרומולקולה הנדרשת נשמרת על הפולימר (איור).

אורז. תוכנית כרומטוגרפיה זיקה

http://www. chemnet. ru / rus / הוראה / שמן / spezprakt-chr. html

לאחר מכן הוא מוסר מהפולימר על ידי העברת תמיסה של תרכובת בעלת זיקה גדולה עוד יותר למקרומולקולה. כרומטוגרפיה כזו יעילה במיוחד בביוטכנולוגיה וביורפואה לבידוד אנזימים, חלבונים, הורמונים.

תלוי ב בדרך הובלת החומרניתן להבחין בין אפשרויות הכרומטוגרפיה הנוזליות הבאות: אקספרסיבי, חזיתיו תְזוּזָה.
משמש לרוב אֶקְסְפּרֶסִיבִיגרסה שבה חלק מהתערובת שיש להפריד מוכנס לעמודה בזרימה של eluent. התשואה של מרכיבי התערובת מהעמודה נרשמת על הכרומטוגרמה כשיאים. (אורז.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image012_4.jpg "רוחב =" 291 "גובה =" 165 ">

אורז. תכנית של גרסה מתפתחת של כרומטוגרפיה

גוֹבַהאוֹ אזור השיאמאפיין ריכוז רכיבים, א מוּחזָק כרכים – הרכב איכותי של התערובת... רכיבים מזוהים בדרך כלל בצירוף מקרים של זמני שמירה עם חומרים סטנדרטיים; נעשה שימוש גם בשיטות כימיות או פיזיקוכימיות.

בְּ חֲזִיתִיבגרסה (איור), תערובת של החומרים שיש להפריד עוברת ברציפות דרך העמוד, הממלאת את התפקיד של שלב נייד. כתוצאה מכך ניתן להשיג בצורה טהורה רק את החומר שהכי פחות נספג בעמודה.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image014_2.jpg "רוחב =" 279 "גובה =" 145 ">

אורז. ערכת כרומטוגרפיה פרונטלית

הכרומטוגרמה במקרה זה מייצגת שלבים, שגובהם פרופורציונלי לריכוזי הרכיבים; נפחי השמירה נקבעים לפי זמן השמירה של הרכיבים. כאשר מבדילים כרומטוגרמה כזו, מתקבלת תמונה הדומה לזו המתקבלת בגרסה המתפתחת.

V תְזוּזָהבגרסה אחרת, מרכיבי התערובת המוכנסים לעמוד מוחלפים על ידי חומר השטף, אשר נספג חזק יותר מכל רכיב. כתוצאה מכך מתקבלים חלקים סמוכים של החומרים להפרדה סדר שחרור הרכיבים נקבע על פי כוח האינטראקציה שלהם עם פני השטח הסופג (איור).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image016_3.jpg "רוחב =" 320 "גובה =" 175 ">

אורז. ערכת כרומטוגרפיה עקירה

3. כמויות כרומטוגרפיות בסיסיות וקביעתן.

בעת הפרדת חומרים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית, ניתן להשתמש בגרסאות המתפתחות, החזיתיות והעקירה, כפי שצוין לעיל. לרוב, נעשה שימוש בגרסה מתפתחת, שבה חלק מהתערובת שיש להפריד מוכנס לעמודה בזרימת המנקה. התשואה של מרכיבי התערובת מהעמודה נרשמת על הכרומטוגרמה כשיאים. מתוך הכרומטוגרמה (איור) קבע:

זמני שמירה של רכיבים בלתי נספגים (t0), מופרדים (tR1, tR2, tR3 וכו'); רוחב בסיס הפסגות (tw1, tw2 וכו').

https://pandia.ru/text/80/271/images/image018_12.gif "width =" 61 "height =" 24 src = ">;

ב) נפח החזקת רכיב מתוקן ,

איפה t "ר -זמן אחזקת רכיב מתוקן;

ג) יחס קיבולת העמודה לרכיב נתון ;

ד) יעילות העמודהמאופיין על ידי מספר לוחות תיאורטיים שוות ערך

https://pandia.ru/text/80/271/images/image022_8.gif "רוחב =" 129 "גובה =" 51 src = ">;

ו) רְשׁוּת https://pandia.ru/text/80/271/images/image024_9.gif "רוחב =" 203 גובה = 51 "גובה =" 51 ">

גורם קיבול ק" יש השפעה משמעותית על הערך ר S: על שינוי ק"מ-0 עד 10 (מגבלות אופטימליות) ר S עולה חזק. מַשְׁמָעוּת ק"נקבע על פי המשטח הכפול של הסורבנט וכמותו בעמודה, וכן קבוע שיווי המשקל בספיחה (הקבוע של הנרי).

מקדם סלקטיביות αנקבע על ידי ההבדל בקבועי שיווי משקל הספיחה של שני הרכיבים המופרדים. עם הגדלת α (מ-1 ל-~5) ר S עולה בחדות, עם עלייה נוספת ב-α - משתנה מעט. סלקטיביות עמודות תלויה בגורמים כגון מבנה כימימשטחים סופגים, הרכב חומר הספיגה, טמפרטורת העמודה ומבנה התרכובות שיש להפריד. מאחר שהספיחה של חומרים שעברו כרומטוגרפיה בכרומטוגרפיה נוזלית נקבעת על ידי אינטראקציה זוגית של שלושת המרכיבים העיקריים של המערכת - הסורבנט, החומרים להפרדה והפלט, שינוי הרכב הפלט הוא דרך נוחה לייעל את תהליך הפרדה.

יעילות עמודותתלוי בגודל החלקיקים ובמבנה הנקבוביות של הסופח, באחידות האריזה של העמוד, בצמיגות של eluent וקצב העברת המסה. הארכת עמודות לא תמיד מובילה להפרדה משופרת, שכן התנגדות העמודה עולה, לחץ הפלונט בכניסה וזמן הניסוי עולים, והרגישות והדיוק של הניתוח יורדים עקב הרחבת השיא של הרכיב המנותח. . אם, אז הפסגות של שני החומרים בכרומטוגרמה מופרדים כמעט לחלוטין. עם צמיחה ר S זמן ההפרדה גדל. בְּ רס < 1 - ההפרדה אינה מספקת. בכרומטוגרפיה הכנה, בקשר להחדרת כמויות גדולות יחסית של חומרים מופרדים, העמוד מופעל בעומס יתר. זה מקטין את יחס הקיבול, מגדיל את הגובה המקביל ללוח התיאורטי, מה שמוביל לירידה ברזולוציה.

4. סופחים

הפרדה כרומטוגרפית של התערובת תהיה יעילה אם הסופח והממס (הפלט) נבחרו בצורה נכונה.

הסופח לא אמור לקיים אינטראקציה כימית עם הרכיבים המופרדים, להפגין השפעה קטליטית על הממס. כמו כן, יש צורך שהסופח יהיה סלקטיבי ביחס למרכיבי התערובת. חומר ייבוש שנבחר כהלכה חייב להיות בעל יכולת ספיגה מקסימלית.

לְהַבחִין קוטבי (הידרופילי)ו סופחים לא קוטביים (הידרופוביים).... יש לזכור שהזיקה הספיחה של חומרים קוטביים לסופגים קוטביים גבוהה בהרבה מזו של לא קוטביים.

תחמוצת אלומיניום, פחמים פעילים, סיליקה ג'ל, זאוליטים, תאית וכמה מינרלים משמשים כסופחים.

תחמוצת אלומיניוםAl2O3 – סופח אמפוטרי.(איור) עליו ניתן להפריד בין תערובות חומרים בקוטבו בממסים לא קוטביים... אלומינה ניטראלית משמשת בדרך כלל לכרומטוגרפיה מתמיסות לא מימיות של פחמימנים רוויים, אלדהידים, אלכוהולים, פנולים, קטונים ואתרים.

אורז. תחמוצת אלומיניום לכרומטוגרפיה

http: // תמונות. /542857_w200_h200_product5.jpg

הפעילות של Al2O3 תלויה בתכולת הלחות שלו. תחמוצת אלומיניום נטול מים היא בעלת הפעילות הגבוהה ביותר. מקובל לקחת את זה כיחידה. במידת הצורך, ניתן להכין אלומינה עם תכולת לחות שונה על ידי ערבוב אלומינה טרייה עם מים (סולם ברוקמן).

תלות בפעילות תחמוצת האלומיניום בתכולת הלחות

לדוגמה, Al2O3 עם פעילות של 1.5-2 משמש להפרדת פחמימנים; להפרדה של אלכוהול וקטונים - 2-3.5.

שטח פנים ספציפי של תחמוצת אלומיניום 230-380 מ"ר / גרם.

סיליקה ג'ל(הידרוקסיל או שונה כימית) הוא דו תחמוצת סיליקון ג'לטיני מיובש, המתקבל מתמיסות על רוויות של חומצות סיליקיות ( נ SiO2 M H2O) ב-pH>5-6. (איור) חומר סופח הידרופילי מוצק.

אורז. סיליקה ג'ל

http://www. סיליקה ג'ל. /

http: // סיליקגל. ru / images / askg. gif

גודל החלקיקים של סיליקה ג'ל בעמודות אנליטיות הוא 3-10 מיקרון, בעמודות הכנה - 20-70 מיקרון. גודל החלקיקים הקטן מגביר את קצב העברת המסה ומשפר את יעילות העמוד. עמודות אנליטיות מודרניות באורך 10-25 ס"מ. הם ממולאים בסיליקה ג'ל בגודל חלקיקים של 5 מיקרון ומאפשרים הפרדה של תערובות מורכבות של 20-30 רכיבים. ככל שגודל החלקיקים יורד ל-3-5 מיקרון, יעילות העמוד עולה, אך גם ההתנגדות שלו עולה. אז כדי להשיג קצב זרימה של חומר הנפט של 0.5-2.0 מ"ל/דקה, נדרש לחץ של (1-3) · 107Pa. סיליקה ג'ל יכול לעמוד בפני ירידת לחץ כזו, בעוד שגרגרי סופגים פולימריים הם אלסטיים יותר ועיוותים. לאחרונה פותחו סורבנטים פולימרים חזקים מכנית בעלי מבנה מקרו-פורוסי עם רשת צפופה, הקרובים לסיליקה ג'לים ביעילותם. לצורת חלקיקי הספיגה בגודל של 10 מיקרומטר ומעלה אין השפעה גדולה על יעילות העמוד, אולם עדיפים סופגים כדוריים המספקים אריזה חדירה יותר (איור).

אורז. סיליקה ג'ל כדורית

http: // תמונות. / 6450630_w200_h200_silicagelksmg. gif

http: ///N6_2011/U7/silikagel-2.jpeg

המבנה הפנימי של חלקיק סיליקה ג'ל הוא מערכת של ערוצי תקשורת. סורבנטים בקוטר נקבוביות של 6-25 ננומטר משמשים לכרומטוגרפיה נוזלית. ההפרדה של כרומטוגרפיה נוזלית מתבצעת בעיקר על ג'לי סיליקה שהשתנו על ידי ריאקציה של אלקיל ו-arylchlorosilanes או אלקיל אתוקסילנים עם קבוצות פני השטח של silanol. בעזרת תגובות כאלה מושתלות קבוצות C8H17-, C18H37- או C6H5- (כדי להשיג חומרי ספיגה עם משטח הידרופובי), ניטריל, קבוצות הידרוקסיל וכו' (איור).

https://pandia.ru/text/80/271/images/image033_0.jpg "width =" 166 "height =" 116 src = ">

אורז. מבנה סיליקה ג'ל שונה

סיליקה ג'ליםמשמש בכרומטוגרפיה להפרדה של תערובות של מוצרי נפט, גבוה יותר חומצות שומן, האסטרים שלהן, אמינים ארומטיים, נגזרות ניטרו תרכובות אורגניות. סיליקה ג'ל – סורבנט הידרופילי, להרטיב בקלות במים. לכן, לא ניתן להשתמש בו לספיגה מתמיסות מימיות. הפעילות של סיליקה ג'ל תלויה בתכולת המים שלו: ככל שהוא מכיל פחות מים, כך יותר פעילות (סולם ברוקמן).

תלות של פעילות סיליקה ג'ל בתכולת הלחות

שטח הפנים הספציפי של ג'ל סיליקה הוא 500-600 מ"ר / גרם.

פחמים פעיליםהם סוג של פחמן שהופך נקבובי במיוחד במהלך העיבוד ורוכש שטח פנים גדול מאוד עבור ספיחה או תגובות כימיות. (איור) יש להם שטח פנים ספציפי של 1300-1700 מ"ר לגרם.

אורז. פחמן פעיל

http: // קטלוג אלקטרוני. rusbiz. ru / user_images / ru / prod_picture / 58035161249b9016f64372.jpg

ההשפעה העיקרית על מבנה הנקבוביות של פחמים פעילים מופעלת על ידי חומרי המוצא לייצורם. פחמים פעילים המבוססים על קליפות קוקוס מאופיינים בשיעור גדול יותר של מיקרו-נקבים (עד 2 ננומטר), על בסיס פחם - שיעור גדול יותר של מזופורות (2-50 ננומטר). חלק גדול מהמאקרופוריות אופייני לפחמים פעילים על בסיס עץ (יותר מ-50 ננומטר). מיקרופוריות מתאימות במיוחד לספיחת מולקולות קטנות ומזופורות מתאימות במיוחד לספיחת מולקולות אורגניות גדולות יותר.

זאוליטים (מסננות מולקולריות)- אלומינוסיליקטים גבישיים נקבוביים של מתכות אלקליות ואדמה אלקליין ממקור טבעי וסינטטי. (אורז.)

https://pandia.ru/text/80/271/images/image036_2.jpg "רוחב =" 211 גובה = 211 "גובה =" 211 ">

אורז. זאוליטים

http://www. זאוליט. spb. ru / _img / _36 מ"מ. jpg

http:// kntgroup. ru / אגודל. php? file = / uploads / produkts / 6.jpg & x_width = 250

ישנם ארבעה סוגים של זאוליטים (A, X, Y, M) עם מבני גביש שונים. בהתאם לקטיון, זאוליטים מוגדרים כדלקמן: KA, NaA, CaM, NaX, KY, CaY. תכונה של זאוליטיםהאם זה לנקבוביות של גבישים יש גדלים בסדר גודל של 0.4-1 ננומטר, המתאימים לגודל המולקולותחומרים נוזליים או גזים רבים. אם מולקולות של חומר מסוגלות לחדור לתוך הנקבוביות הללו, אזי מתרחשת ספיחה בנקבוביות של גבישי זאוליט. מולקולות גדולות יותר של חומר אינן נספגות. על ידי בחירת זאוליטים עם גדלים שונים של נקבוביות, ניתן להפריד בבירור תערובות של חומרים שונים.

שטח הפנים הספציפי של זאוליטים הוא 750-800 מ"ר / גרם.

בעת בחירת סופח, יש צורך לקחת בחשבון את מבנה החומרים ואת מסיסותם. לדוגמה, פחמימנים רוויים נספגים בצורה גרועה, בעוד שלא רוויים (בעלי קשרים כפולים) נספגים טוב יותר. קבוצות פונקציונליות משפרות את יכולת הספיחה של חומר.

5. מחממים

בבחירת ממס (פלט) יש צורך לקחת בחשבון את אופי הסופח ואת תכונות החומרים בתערובת המיועדת להפרדה. חומרי הגמילה צריכים להמיס היטב את כל מרכיבי התערובת שעברה כרומטוגרפיה, בעלי צמיגות נמוכה, לספק את רמת הסלקטיביות הנדרשת, להיות זולים, לא רעילים, אינרטיים ותואמים לשיטות זיהוי (לדוגמה, בנזן לא יכול לשמש כמפלט עם גלאי UV).

כרומטוגרפיה של פאזה רגילה משתמשת בדרך כלל בפחמימנים (הקסאן, הפטאן, איזואקטן, ציקלוהקסאן) בתוספת כמויות קטנות של כלורופורם CHCl3, איזופרופנול iso-C3H7OH, אתר דיאיזופרופיל; בכרומטוגרפיה הפוכה - תערובת של מים עם אצטוטריל CH3CN, מתנול CH3OH, אתנול C2H5OH, דיוקסן, טטרהידרופורן, דימתילפורמאמיד. כדי לבודד את הרכיבים הבודדים של התערובת, המופרדים במהלך הכרומטוגרפיה, הם נשטפים ברצף החוצה (נפלטים). למטרה זו משתמשים בממיסים בעלי יכולות ספיחה שונות. הממיסים מסודרים בסדר יורד של יכולת הספיגה בסופחים קוטביים - סדרת Trappe eluotropic... אם למרכיבי התערובת שיש להפריד יש ערכים קרובים ק"(יחס קיבולת העמודה ביחס לרכיב נתון), ולאחר מכן כרומטוגרפית עם eluent אחד. אם הרכיבים האישיים של התערובת נשמרים היטב על ידי הסורבנט, נעשה שימוש בסדרה של eluents בעלי חוזק הולך וגובר.

מגוון אלווטרופי של ממיסים

6. ציוד לכרומטוגרפיה נוזלית

בכרומטוגרפיה נוזלית מודרנית משתמשים במכשירים בדרגות מורכבות שונות - מהמערכות הפשוטות ביותר ועד לכרומטוגרפים ברמה גבוהה.
כרומטוגרף נוזלי חדיש כולל: מיכלים לחומרים, משאבות בלחץ גבוה, מתקן, עמוד כרומטוגרפי, גלאי, מכשיר הקלטה, מערכת בקרה ועיבוד מתמטי של תוצאות.

באיור. מציג תרשים בלוקים של כרומטוגרף נוזלי המכיל את סט הרכיבים המינימלי הנדרש, בצורה כזו או אחרת, הקיים בכל מערכת כרומטוגרפית.

https://pandia.ru/text/80/271/images/image038_2.jpg "width =" 361 "height =" 254 src = ">

אורז. תרשים של כרומטוגרף נוזלי: 1- מאגר לשלב הנייד, 2- משאבה, 3- מזרק, 4- עמודות, 5- תרמוסטט, 6- גלאים, 7- מערכת הקלטה, 8- מחשב.

מיכל אחסוןלשלב הנייד, חייב להיות בעל יכולת מספקת לניתוח ו מכשיר הסרת גז ממסיםכדי לא לכלול היווצרות של בועות של גזים מומסים במפלט בעמודה ובגלאי.

לִשְׁאוֹבהתכוון ליצור זרימה מתמדת של ממס... העיצוב שלו נקבע בעיקר על ידי לחץ הפעולה במערכת. לפעולה בטווח של 10-500 MPa, משתמשים במשאבות מסוג בוכנה (מזרק). החיסרון שלהם הוא הצורך בהפסקות תקופתיות למילוי חומר eluent. עבור מערכות פשוטות עם לחצי הפעלה נמוכים של 1-5 MPa, משתמשים במשאבות פריסטלטיות זולות. חומרי הגמילה נכנסים למשאבה דרך מסנן השומר על חלקיקי אבק (יותר מ-0.2 מיקרון). לפעמים עובר זרם קטן של הליום דרך חומרי הגלישה כדי להסיר אוויר מומס ולמנוע היווצרות בועות בגלאי (במיוחד במקרה של eluents מימי וקוטבי). בכרומטוגרפיות אנליטיות, משאבות בוכנה עם מערכת משוב משמשות לאספקת ה-eluent לעמוד, המאפשרות להחליק את פעימת הזרימה תוך 1-2% ולספק מהירויות נפחיות מ-0.1 עד 25 מ"ל/דקה בלחצים של עד ~ 3.107 פא. בכרומטוגרפיה של מיקרו-עמודות, קצבי הזרימה הנפחיים של חומר הפלטה נמוכים בהרבה - 10-1000 μl / דקה. במקרה של פליטת שיפוע, נעשה שימוש במספר משאבות, הנשלטות על ידי מתכנת ומספקות 2-3 מרכיבים של הפלואנט לתא הערבוב, ומשאירות את קצב הזרימה הכולל קבוע. כדי להזריק דגימה לעמודה בלחץ גבוה, מבלי לעצור את הזרימה, השתמש בברזי מיקרו מינון מיוחדים המחוברים ללולאה בנפח ידוע עבור דגימת התמיסה הנחקרת. פותחו מערכות מינון עם דגימה אוטומטית והזרקת דגימות באמצעות שסתומי מיקרו מינון או מזרקים.

מַזרֵקמספק הזרקת דגימת תערובתיש להפריד רכיבים לעמוד עם יכולת שחזור גבוהה מספיק. מערכות דגימה פשוטות של עצירת זרימה דורשות עצירת משאבה ולכן הן פחות נוחות ממכשירי לולאה של Reodyne.

רמקוליםעבור HPLC עשויים לרוב מצינור נירוסטה מלוטש באורך 10-25 ס"מ ובקוטר פנימי של 3-5 מ"מ.

אורז. עמודות כרומטוגרפיה לכרומטוגרפיה נוזלית

תשתמש גם עמודי זכוכיתמונח במעטפת מתכת; בכרומטוגרפיה של מיקרו-עמודות - עמודי מתכת מודפסיםעם קוטר פנימי של 1.0-1.5 מ"מ, מיקרועמודות זכוכית מודפסותבקוטר של 70-150 מיקרון ו עמודים נימיים חלוליםבקוטר של 10-100 מיקרון; בכרומטוגרפיה הכנה - עמודים בקוטר 2 עד 10 ס"מ ויותר. למילוי אחיד וצפוף של עמודים עם סורבנט, נעשה שימוש בשיטת אריזת השעיה. את התרחיף מכינים מסורבנט ומנוזל אורגני מתאים, המסופקים בלחץ של עד 5×107 Pa לעמוד. כדי לקבוע את הרכיבים המופרדים היוצאים מהעמודהלהשתמש גלאים. קביעות טמפרטורהמסופק תֶרמוֹסטָט.

גלאיםעבור כרומטוגרפיה נוזלית יש תא זרימה שבו יש מדידה רציפה של כל תכונה של eluent זורם. הם חייבים להיות מאוד רגישים. כדי להגביר את רגישות הגלאי, לעיתים נעשה שימוש בגזרת מרכיבי התערובת לאחר העמודה. לשם כך, עם זרימת eluent, מכניסים ריאגנטים כאלה אשר, תוך אינטראקציה עם החומרים המופרדים, יוצרים נגזרות בעלות תכונות בולטות יותר, למשל, הם סופגים חזק יותר באזור ה-UV או הגלוי של הספקטרום או בעלות פלואורסצנטי רב יותר. יְכוֹלֶת. לפעמים נגזרת מתבצעת לפני ניתוח כרומטוגרפי והנגזרות מופרדות ולא מחומרי המוצא. הסוגים הפופולריים ביותר גלאיםמטרה כללית הם רפרקטומטריםמדידה מקדם השבירה, ו גלאים ספקטרופוטומטרייםמגדיר צפיפות אופטית של הממסבאורך גל קבוע (בדרך כלל באזור האולטרה סגול). ל היתרונות של רפרקטומטרים(ו החסרונות של ספקטרופוטומטרים) יש לייחס רגישות נמוכה לסוג של קשרים, אשר עשוי להכיל או לא להכיל קבוצות כרומופוריות. מצד שני, השימוש ברפרקטומטר מוגבל למערכות איזוקרטיות (עם הרכב eluent קבוע), כך ששימוש בגרדיאנט ממס אינו אפשרי במקרה זה.

דיפרנציאלי "href =" / text / category / differentcial / "rel =" bookmark "> מגבר דיפרנציאלי ומקליט. אינטגרטור, המאפשר לך לחשב את השטחים היחסיים של הפסגות המתקבלות. שימוש במערכות כרומטוגרפיות מורכבות יחידת ממשקחיבור הכרומטוגרף עם מחשב אישי, אשר מבצעת לא רק איסוף ועיבוד מידע, אלא גם שולטת במכשיר, מחשבת את המאפיינים הכמותיים ובמקרים מסוימים את ההרכב האיכותי של תערובות. מיקרו - מעבדמספק הזרקת דגימה אוטומטית, לשנות לפי תוכנית נתונה של הרכב eluentעם פליטת שיפוע, שמירה טמפרטורת העמודה.

ברוקר".אורז. כרומטוגרף נוזלי ג'סקו

שאלות בדיקה עצמית

רשימת ספרות משומשת

1 "כרומטוגרפיית נוזלים ברפואה"

Http: // יומן. issep. rssi. ru / מאמרים / pdf / 0011_035.pdf

2 "מבוא לשיטות של כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים"

Http: // www. chemnet. ru / rus / הוראה / שמן / spezprakt-chr. html

3 "כרומטוגרפיית נוזלים"

Http: // e-science. ru / index /? id = 1540

4 "כרומטוגרפיה"

Http: // belchem. narod. ru / chromatography1.html

"כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים של מזהמים טבעיים ושפכים"

מבוא

פרק 1. מושגי יסוד וסיווג שיטות כרומטוגרפיה נוזליות

1.1 מכשיר לכרומטוגרפיה נוזלית

פרק 2. המהות של HPLC

2.1 יישום

פרק 3. דוגמאות לשימוש ב-HPLC בניתוח עצמים סביבתיים

פרק 4. ציוד עבור HPLC

סִפְרוּת

יישום

מבוא

שיטות כרומטוגרפיותהם לרוב הכרחיים לזיהוי וכימות של חומרים אורגניים בעלי מבנה דומה. יחד עם זאת, השימוש הנרחב ביותר לניתוח שגרתי של מזהמים סביבתיים הם כרומטוגרפיה של גז ונוזלים בביצועים גבוהים. ניתוח גז כרומטוגרפי של מזהמים אורגניים במי השתייה והשפכים התבסס תחילה על שימוש בעמודים ארוזים, מאוחר יותר הפכו גם עמודי נימי קוורץ לנפוצים. הקוטר הפנימי של העמודים הנימים הוא בדרך כלל 0.20-0.75 מ"מ, האורך הוא 30-105 מ'. תוצאות אופטימליות בניתוח של מזהמים במים מושגות לרוב כאשר משתמשים בעמודות נימיות עם עובי סרט שונה העשויים מתילפנילסיליקונים עם קבוצות פניל ​​של 5 ו-50%... מערכת ההקדמה לדוגמה הופכת לעתים קרובות לפגיעות בטכניקות כרומטוגרפיות באמצעות עמודות נימיות. ניתן לחלק מערכות מבוא לדוגמה לשתי קבוצות: אוניברסלית וסלקטיבית. יישומים רב-תכליתיים כוללים מערכות הזרקה מפוצלות וללא פיצול, הזרקת עמודה "קרה", ואיוד מתוכנת בטמפרטורה. בהזרקה סלקטיבית נעשה שימוש בנשיפה עם לכידת ביניים, ניתוח מרווח ראש וכו'. בעת שימוש במערכות הזרקה אוניברסליות, כל הדגימה מסופקת לעמוד; בהזרקה סלקטיבית מוזרק רק חלק מסוים. התוצאות המתקבלות בהזרקה סלקטיבית הן הרבה יותר מדויקות, שכן החלק הנכנס לעמוד מכיל רק חומרים נדיפים, והטכניקה יכולה להיות אוטומטית לחלוטין.

גלאי גז כרומטוגרפיים המשמשים בניטור מזהמים מחולקים לרוב לגלאים אוניברסליים המגיבים לכל רכיב בשלב הנייד, ולגלאים סלקטיביים המגיבים לנוכחות של קבוצה מסוימת של חומרים בעלי מאפיינים כימיים דומים בשלב הנייד. האוניברסליים כוללים יינון להבה, פליטת אטום, גלאים ספקטרומטריים מסה וספקטרומטריית אינפרא אדום. גלאים סלקטיביים המשמשים בניתוח מים הם לכידת אלקטרונים (סלקטיבית לחומרים המכילים אטומי הלוגן), תרמויוניים (בררניים לתרכובות המכילות חנקן וזרחן), פוטויוניזציה (סלקטיבית לפחמימנים ארומטיים), גלאי מוליכות אלקטרוליטית (סלקטיבית לתרכובות, המכילות אטומים של הלוגנים). , גופרית וחנקן). הכמויות המינימליות הניתנות לזיהוי של חומרים הן מננוגרם ועד פיקוגרם לשנייה.

כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים(HPLC) היא שיטה אידיאלית לקביעת מספר רב של תרכובות לאביליות תרמית שלא ניתן לנתח באמצעות כרומטוגרפיה גז. אגרוכימיקלים מודרניים, כולל מתיל קרבונטים וחומרי הדברה אורגנו-פוספטים, וחומרים לא נדיפים אחרים, הופכים לעתים קרובות לאובייקטים של ניתוח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים צוברת פופולריות בקרב שיטות אחרות המשמשות בניטור סביבתי, גם בגלל שיש לה סיכויים מזהירים במונחים של אוטומציה של הכנת דגימות.

פרק 1. מושגים בסיסיים וסיווג של שיטות כרומטוגרפיה נוזלית

כרומטוגרפיה נוזלית מסווגת למספר מחלקות בהתאם לסוג התמיכה בשלב נייח. עיצוב חומרה פשוט של נייר וכרומטוגרפיה בשכבה דקה הוביל לשימוש נרחב בשיטות אלו בפרקטיקה אנליטית. עם זאת, האפשרויות הגדולות של כרומטוגרפיה של עמודת נוזלים עוררו את שיפור הציוד לשיטה הקלאסית הזו והובילו להחדרה מהירה של HPLC. העברת הבורר דרך העמוד בלחץ גבוה אפשרה להגדיל באופן דרמטי את קצב הניתוח ולהגדיל משמעותית את יעילות ההפרדה עקב השימוש בחומר סופג מפוזר דק. שיטת HPLC מאפשרת כיום לבודד, כמותית ואיכותית תערובות מורכבות של תרכובות אורגניות.

על פי מנגנון האינטראקציה של החומר שיש להפריד (eluate) עם הפאזה הנייחת, מבחינים בכרומטוגרפיה של ספיחה, הפצה, חילופי יונים, אי הכללת גודל, צמד יונים, חילופי ליגנד וזיקה.

כרומטוגרפיה של ספיחה... ההפרדה באמצעות כרומטוגרפיה ספיחה מתבצעת כתוצאה מאינטראקציה של החומר המיועד להפרדה עם חומר סופח, כגון אלומינה או סיליקה ג'ל, בעלי מרכזי קוטב פעילים על פני השטח. הממס (הפלט) הוא נוזל לא קוטבי. מנגנון הספיחה מורכב מאינטראקציה ספציפית בין פני השטח הקוטביים של הסורבנט לבין האזורים הקוטביים (או בעלי יכולת הקיטוב) של המולקולות של הרכיב המנותח (איור 1).

אורז. 1. כרומטוגרפיית נוזל ספיחה.

כרומטוגרפיה של מחיצה... בוריאנט הפצה של כרומטוגרפיית נוזלים, ההפרדה של תערובת של חומרים מתבצעת בשל ההבדל במקדמי הפיזור שלהם בין שני שלבים בלתי ניתנים לערבב - ה-eluent (פאזה ניידת) והפאזה על הסורבנט (פאזה נייח).

בְּ שלב רגילבווריאציה של כרומטוגרפיה נוזלית הפצה, נעשה שימוש בחוט eluent לא קוטבי ובקבוצות קוטביות, המושתלות על פני השטח של הסורבנט (לרוב, סיליקה ג'ל). אלקילכלורוסילאנים מוחלפים המכילים קבוצות קוטביות, כגון ניטריל, קבוצות אמינו וכו', משמשים כמשנים של משטח סיליקה ג'ל (שלבים מושתלים) (איור 2). השימוש בפאזות מושתלות מאפשר לשלוט עדין בתכונות הספיחה של משטח הפאזה הנייחת ולהשיג יעילות הפרדה גבוהה.

אורז. 2. כרומטוגרפיה מחיצה עם פאזה מושתלת (וריאנט פאזה רגילה).

שלב הפוךכרומטוגרפיה נוזלית מבוססת על התפלגות מרכיבי התערובת בין הפולארי הקוטבי לקבוצות לא קוטביות (שרשרות אלקיל ארוכות) המושתלות על פני השטח הסופג (איור 3).

אורז. 3. כרומטוגרפיה של מחיצת פאזה מושתלת (גרסת פאזה הפוכה).

גרסה פחות נפוצה של כרומטוגרפיה נוזלית עם פאזות נתמכות היא כאשר שלב נייח נוזלי מופקד על תומך נייח.

בלעדי (חודר ג'ל)כרומטוגרפיה היא גרסה של כרומטוגרפיה נוזלית, בה הפרדת החומרים מתרחשת עקב התפלגות מולקולות בין הממס בנקבוביות הסורבנט לבין הממס הזורם בין חלקיקיו.

אפיןכרומטוגרפיה מבוססת על אינטראקציות ספציפיות של החלבונים (נוגדנים) המופרדים עם חומרים (אנטיגנים) המושתלים על פני השטח של הסורבנט (שרף סינטטי), ויוצרים באופן סלקטיבי קומפלקסים (מצומדים) עם חלבונים.

כרומטוגרפיה של חילופי יונים, צמד יונים, חילופי ליגנדים משמשים בעיקר בניתוח אנאורגני.

פרמטרים בסיסיים של הפרדה כרומטוגרפית.

הפרמטרים העיקריים של הפרדה כרומטוגרפית הם נפח השמירה וזמן השמירה של מרכיב התערובת (איור 4).

זמן השמירה tR הוא הזמן שחלף מרגע הזרקת הדגימה לעמוד ועד להופעת המקסימום של השיא המתאים. על ידי הכפלת זמן ההחזקה במהירות הנפחית F, נקבל את נפח ההחזקה VR:

זמן שמירה מתוקן - הזמן שחלף מרגע הופעת השיא המרבי של הרכיב הלא נספג ועד לשיא התרכובת המקבילה:

tR "= tR - t0 ;

נפח ההחזקה המופחת או המתוקן הוא נפח ההחזקה המתוקן עבור נפח ההחזקה בעמודה V0, כלומר נפח ההחזקה של הרכיב הלא נספג:

VR "= VR - V0;

מאפיין השמירה הוא גם מקדם הקיבולת k ", המוגדר כיחס בין מסת החומר בשלב הנייח למסת החומר בשלב הנייד: k" = mn / mp;

קל לקבוע את ערך k "מהכרומטוגרמה:

הפרמטרים החשובים ביותר של הפרדה כרומטוגרפית הם היעילות והסלקטיביות שלה.

יעילות העמוד, נמדדת בגובה הלוחות התיאורטיים (HETT) ובפרופורציה הפוכה למספרם (N), ככל שגבוהה יותר כך שיא החומר היוצא באותו זמן החזקה צר יותר. ניתן לחשב את ערך היעילות מהכרומטוגרמה באמצעות הנוסחה הבאה:

N = 5.54. (tR / 1/2) 2,

איפה tR- זמן שמירה,

w 1/2 - רוחב שיא בחצי גובה

בידיעה של מספר הלוחות התיאורטיים בעמודה, אורך העמודה L וקוטר גרגר הסופג הממוצע dc, קל לקבל את ערכי הגובה המקבילים ללוח התיאורטי (HETT) והגובה המופחת (PVETT):

VETT = L / N PVETT = VETT / d c

מאפיינים אלו מאפשרים השוואת יעילות של סוגים שונים של עמודים, הערכת איכות הסורבנט ואיכות מילוי העמודים.

הסלקטיביות של ההפרדה של שני חומרים נקבעת על ידי המשוואה:

כאשר בוחנים את ההפרדה של תערובת של שני רכיבים, פרמטר חשוב הוא גם מידת ההפרדה RS:

;

פסגות נחשבות למותרות אם ערך ה-RS גדול או שווה ל-1.5.

הפרמטרים הכרומטוגרפיים העיקריים מקושרים על ידי המשוואה הבאה לרזולוציה:

;

הגורמים הקובעים את סלקטיביות ההפרדה הם:

1) האופי הכימי של הסורבנט;

2) הרכב הממס והמשתנים שלו;

3) המבנה הכימי ותכונותיהם של מרכיבי התערובת המיועדת להפרדה;

4) טמפרטורת העמודה

1.1 מכשיר לכרומטוגרפיה נוזלית

בכרומטוגרפיה נוזלית מודרנית משתמשים במכשירים בדרגות מורכבות שונות - מהמערכות הפשוטות ביותר ועד לכרומטוגרפים ברמה גבוהה המצוידים במכשירים נוספים שונים.

באיור. 4. מוצג תרשים בלוקים של כרומטוגרף נוזלי, המכיל את סט הרכיבים המינימלי הנדרש, בצורה כזו או אחרת, הקיים בכל מערכת כרומטוגרפית.

אורז. 4. דיאגרמת בלוקים של כרומטוגרף נוזלי.

המשאבה (2) נועדה ליצור זרימה קבועה של ממס. העיצוב שלו נקבע בעיקר על ידי לחץ הפעולה במערכת. לפעולה בטווח של 10-500 MPa, משתמשים בבוכנה (מזרק) או במשאבות מסוג בוכנה. החיסרון של הראשון הוא הצורך בהפסקות תקופתיות למילוי בחומר הפלטה, ושל השני, המורכבות הרבה של העיצוב וכתוצאה מכך המחיר הגבוה. עבור מערכות פשוטות עם לחצים הפעלה נמוכים של 1-5 MPa, משאבות פריסטלטיות זולות משמשות בהצלחה, אך מכיוון שקשה להשיג לחץ וקצב זרימה קבועים, השימוש בהן מוגבל למשימות הכנה.

המזרק (3) מבטיח שדגימה של תערובת רכיבים להפרדה מוזרקת לעמוד עם יכולת שחזור גבוהה מספיק. מערכות דגימה פשוטות של עצירת זרימה דורשות עצירת משאבה ולכן הן פחות נוחות ממכשירי לולאה של Reodyne.

עמודי ה-HPLC (4) הם צינורות נירוסטה בעלי דופן עבה שיכולים לעמוד בלחץ גבוה. תפקיד חשוב הוא על ידי הצפיפות והאחידות של אריזת העמודה עם הסורבנט. לכרומטוגרפיה נוזלית לחץ נמוךעמודי זכוכית עבי דופן משמשים בהצלחה. קביעות הטמפרטורה מובטחת על ידי תרמוסטט (5).

לגלאים (6) לכרומטוגרפיה נוזלים יש תא זרימה שבו נמדדת באופן רציף תכונה כלשהי של חומר הנזלת הזורם. הסוגים הפופולריים ביותר של גלאים לשימוש כללי הם רפרקטומטרים, המודדים את מקדם השבירה, וגלאים ספקטרופוטומטריים, המודדים את הספיגה של ממס באורך גל קבוע (בדרך כלל באזור האולטרה סגול). היתרונות של רפרקטומטרים (והחסרונות של ספקטרופוטומטרים) כוללים רגישות נמוכה לסוג התרכובת הנקבעת, שאולי לא מכילה קבוצות כרומופוריות. מצד שני, השימוש ברפרקטומטר מוגבל למערכות איזוקרטיות (עם הרכב eluent קבוע), כך ששימוש בגרדיאנט ממס אינו אפשרי במקרה זה.

עמודות HPLC, המשמשות לרוב בניתוח מזהמים סביבתיים, הן באורך 25 ס"מ ובקוטר פנימי של 4.6 מ"מ, מלאות בחלקיקי סיליקה ג'ל כדוריים בגודל 5-10 מיקרומטר עם קבוצות אוקטדציל מושתלות. בשנים האחרונות הופיעו עמודים בעלי קטרים ​​פנימיים קטנים יותר, מלאים בחלקיקים קטנים יותר. השימוש בעמודים כאלה מביא לירידה בצריכת הממיסים ובמשך הניתוח, לעלייה ברגישות וביעילות ההפרדה, וכן מקל על בעיית חיבור העמודים לגלאים ספקטרליים. עמודות בקוטר פנימי של 3.1 מ"מ מצוידות במחסנית בטיחות (קדם-עמודה) להגדלת חיי השירות ולשיפור יכולת השחזור של ניתוחים.

כגלאים במכשירי HPLC מודרניים, משתמשים בדרך כלל בגלאי UV על מטריצת דיודה, פלואורסצנציה ואלקטרוכימיה.

יש לזכור שבעבודה מעשית, ההפרדה מתרחשת לעתים קרובות לא בזה אחר זה, אלא באמצעות מספר מנגנונים בו זמנית. אז, הפרדת ההדרה מסובכת על ידי השפעות ספיחה, הפצה ספיחה, ולהיפך. יתרה מכך, ככל שההבדל בין החומרים בדגימה גדול יותר מבחינת מידת היינון, בסיסיות או חומציות, משקל מולקולרי, קיטוב ופרמטרים נוספים, כך גדלה הסבירות למנגנון הפרדה שונה לחומרים מסוג זה.

בפועל, הנפוצה ביותר היא כרומטוגרפיה של "הפיכה הפוכה" (Reversed Phase), שבה השלב הנייח אינו קוטבי, אלא הפאזה הניידת היא קוטבית (כלומר, ההיפוך של הכרומטוגרפיה "הפאזה הישיר").

ברוב המעבדות בעולם, קבוצה של 16 PAHs עדיפות מנותחת על ידי HPLC או CMS.

פרק 2. מהות HPLC

בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), אופי התהליכים המתרחשים בעמודה כרומטוגרפית זהה בדרך כלל לתהליכים בכרומטוגרפיית גז. ההבדל היחיד הוא השימוש בנוזל כשלב נייח. בשל הצפיפות הגבוהה של שלבים ניידים נוזליים ועמידות עמודות גבוהה, כרומטוגרפיית גז ונוזלים נבדלים מאוד בתכנון החומרה שלהם.

ב-HPLC, ממיסים טהורים או תערובות שלהם משמשים בדרך כלל כשלבים ניידים.

כדי ליצור זרם של ממס טהור (או תערובות של ממסים), הנקרא eluent בכרומטוגרפיה נוזלית, משתמשים במשאבות במערכת ההידראולית של הכרומטוגרף.

כרומטוגרפיית ספיחה מתבצעת כתוצאה מאינטראקציה של חומר עם חומרי ספיגה, כגון סיליקה ג'ל או אלומינה, בעלי מרכזים פעילים על פני השטח. ההבדל ביכולת לקיים אינטראקציה עם מרכזי הספיחה של מולקולות מדגם שונות מוביל לחלוקה שלהן לאזורים במהלך התנועה עם הפאזה הניידת לאורך העמוד. ההפרדה בין אזורי הרכיבים המושגת במקרה זה תלויה באינטראקציה עם הממס והן עם הסופח.

סופחי סיליקה ג'ל בעלי נפחים שונים, משטחים וקוטרים שונים של נקבוביות נמצאים בשימוש נרחב ביותר ב-HPLC. אלומינה וסופחים אחרים משמשים בתדירות נמוכה בהרבה. הסיבה העיקרית לכך:

חוזק מכני לא מספיק, אשר אינו מאפשר אריזה ושימוש כאשר לחצים גבוהיםאופייני ל-HPLC;

לסיליקה ג'ל, בהשוואה לתחמוצת אלומיניום, יש מגוון רחב יותר של נקבוביות, שטח פנים וקוטר נקבוביות; פעילות קטליטית גבוהה משמעותית של תחמוצת אלומיניום מובילה לעיוות של תוצאות הניתוח עקב פירוק רכיבי הדגימה או כימיסורפציה בלתי הפיכה שלהם.

גלאי HPLC

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) משמשת לאיתור חומרים קוטביים לא נדיפים שמסיבה כלשהי לא ניתן להמיר אותם לצורה נוחה לכרומטוגרפיה גז, אפילו בצורה של נגזרות. חומרים אלה כוללים, במיוחד, חומצות סולפוניות, צבעים מסיסים במים וכמה חומרי הדברה, כגון נגזרות של פניל-אוריאה.

גלאים:

UV - גלאי מערך דיודות. ה"מטריקס" של פוטודיודות (יש יותר ממאתיים מהן) רושמת כל הזמן אותות באזורי ה-UV והספקטרלים הנראים לעין, ובכך מספקת את ההקלטה של ​​ספקטרום UV-B במצב הסריקה. זה מאפשר להקליט ברציפות ברגישות גבוהה ספקטרום לא מעוות של רכיבים העוברים במהירות דרך תא מיוחד.

בהשוואה לזיהוי אורך גל בודד, שאינו מספק מידע על "טוהר" השיא, היכולת להשוות את מלוא הספקטרום של מערך דיודות מספקת תוצאת זיהוי במידה הרבה יותר גדולה של ביטחון.

גלאי פלורסנט. הפופולריות הרבה של גלאי פלורסנט נובעת מהסלקטיביות והרגישות הגבוהות מאוד, ומהעובדה שמזהמים סביבתיים רבים מקרינים (למשל, פחמימנים פוליארומטיים).

גלאי אלקטרוכימי משמש לאיתור חומרים אשר מתחמצנים או מופחתים בקלות: פנולים, מרקפטנים, אמינים, נגזרות ניטרו ארומטיות והלוגן, קטון אלדהידים, בנזידינים.

הפרדה כרומטוגרפית של התערובת על העמוד עקב התקדמות איטית של ה-PP אורכת זמן רב. כדי להאיץ את התהליך, כרומטוגרפיה מתבצעת בלחץ. שיטה זו נקראת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC).

מודרניזציה של הציוד המשמש בכרומטוגרפיה קלאסית של עמודת נוזלים הפכה אותו לאחת משיטות הניתוח המבטיחות והמודרניות ביותר. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים היא שיטה נוחה להפרדה, בידוד הכנה וניתוח איכותי וכמותי של תרכובות תרמולאביליות לא נדיפות במשקל מולקולרי נמוך וגבוה כאחד.

בהתאם לסוג הסורבנט המשמש בשיטה זו, נעשה שימוש ב-2 אפשרויות כרומטוגרפיה: על סורבנט קוטבי באמצעות eluent לא קוטבי (אפשרות שלב ישיר) ועל סורבנט לא קוטבי באמצעות eluent קוטבי - מה שנקרא הפוך- כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC).

כאשר הבורר עובר למפלט, שיווי המשקל בתנאי HPLC נוצר הרבה פעמים מהר יותר מאשר בתנאים של סופגים קוטביים ו-PPs לא מימיים. כתוצאה מכך, כמו גם הנוחות בעבודה עם חומרים מימיים ומימיים-אלכוהוליים, Off-HPLC צבר פופולריות רבה בזמן הנוכחי. רוב ניתוחי HPLC מבוצעים בשיטה זו.

גלאים. רישום היציאה מהעמודה של רכיב נפרד מתבצע באמצעות גלאי. לרישום, ניתן להשתמש בשינוי בכל אות אנליטי המגיע משלב הנייד ומשויך לאופי ולכמות של מרכיב התערובת. בכרומטוגרפיה נוזלית משתמשים באותות אנליטיים כמו בליעת אור או פליטת אור של תמיסת הפלט (גלאים פוטומטריים ופלואומטריים), מקדם שבירה (גלאים רפרקטומטריים), פוטנציאל ומוליכות חשמלית (גלאים אלקטרוכימיים) וכו'.

האות שזוהה ברציפות מוקלט על ידי מקליט. כרומטוגרמה היא רצף של אותות גלאים המוקלטים בקלטת ההקלטה, הנוצרים כאשר הרכיבים הבודדים של התערובת עוזבים את העמודה. במקרה של הפרדת התערובת, פסגות בודדות נראים על הכרומטוגרמה החיצונית. מיקום הפסגה על הכרומטוגרמה משמש לצורכי זיהוי, הגובה או השטח של הפסגה משמשים למטרות כימות.

2.1 יישום

HPLC נמצא בשימוש הנפוץ ביותר בתחומים הבאים של ניתוח כימי (מושגים של ניתוח מודגשים, כאשר ל-HPLC אין כמעט תחרות):

בקרת איכות המזון - תוספים טוניק ותוספי טעם, אלדהידים, קטונים, ויטמינים, סוכרים, צבעים, חומרים משמרים, תרופות הורמונליות, אנטיביוטיקה, טריאזין, קרבמט וחומרי הדברה אחרים, מיקוטוקסינים, ניטרוסמינים, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים וכו'.

· הגנת הסביבה - פנולים, תרכובות ניטרו אורגניות, פחמימנים ארומטיים חד ופוליציקליים, מספר חומרי הדברה, אניונים עיקריים וקטיונים.

· מדע משפטי - סמים, חומרי נפץ וצבעים אורגניים, תרופות חזקות.

· תעשיית התרופות - הורמונים סטרואידים, כמעט כל מוצרי סינתזה אורגניים, אנטיביוטיקה, תכשירים פולימרים, ויטמינים, תכשירי חלבון.

רפואה - רשום ביוכימי ו חומרים רפואייםוהמטבוליטים שלהם בנוזלים ביולוגיים (חומצות אמינו, פורינים ופירמידינים, הורמונים סטרואידים, שומנים) באבחון מחלות, קביעת קצב סילוק התרופות מהגוף לצורך המינון האישי שלהן.

· חַקלָאוּת- קביעת ניטראט ופוספט בקרקעות לקביעת הכמות הנדרשת של דשנים מיושמים, קביעת הערך התזונתי של מזון (חומצות אמינו וויטמינים), ניתוח חומרי הדברה בקרקע, מים ומוצרים חקלאיים.

ביוכימיה, כימיה ביו-אורגנית, הנדסה גנטית, ביוטכנולוגיה - סוכרים, ליפידים, סטרואידים, חלבונים, חומצות אמינו, נוקלאוזידים ונגזרותיהם, ויטמינים, פפטידים, אוליגונוקלאוטידים, פורפירינים וכו'.

· כימיה אורגנית - כל המוצרים היציבים של סינתזה אורגנית, צבעים, תרכובות תרמו-לאביליות, תרכובות לא נדיפות; כימיה אנאורגנית(כמעט כל התרכובות המסיסות בצורת יונים ותרכובות מורכבות).

· בקרת איכות ובטיחות של מוצרי מזון, משקאות אלכוהוליים ולא אלכוהוליים, מי שתייה, כימיקלים ביתיים, בשמים בכל שלבי ייצורם;

· קביעת אופי הזיהום באתר אסון או חירום מעשה ידי אדם;

· איתור וניתוח של חומרים נרקוטיים, חזקים, רעילים ונפיצים;

· קביעת נוכחותם של חומרים מזיקים (פחמימנים פוליציקליים ואחרים ארומטיים, פנולים, חומרי הדברה, צבעים אורגניים, יונים של מתכות כבדות, אלקליות ואדמה אלקליות) בשפכים נוזליים, פליטות אוויר ופסולת מוצקה של מפעלים ובאורגניזמים חיים;

· ניטור תהליכי סינתזה אורגניים, זיקוק נפט ופחם, תעשיות ביוכימיות ומיקרוביולוגיות;

ניתוח איכות הקרקע לדישון, הימצאות חומרי הדברה וקוטלי עשבים בקרקע, מים ומוצרים, וכן הערך התזונתי של מזון; משימות אנליטיות מחקריות מורכבות; השגת כמות עקבית של חומר טהור במיוחד.

פרק 3. דוגמאות לשימוש ב-HPLC בניתוח אובייקטים סביבתיים

HPLC - שיטה לניטור PAH באובייקטים סביבתיים

עבור פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAH), חומרים אקולוגיים מדרגת הסיכון הראשון, נקבעו רמות נמוכות במיוחד של ריכוזים מקסימליים (MPC) בחפצים טבעיים. קביעת ה-PAHs ברמת MPC ומטה היא אחת המשימות האנליטיות המורכבות מאוד ושיטות ניתוח היי-טק (GC-MS, GC, HPLC) משמשות לפתרון אותן. בבחירת שיטת ניטור, למאפיינים הנחשבים העיקריים - מתווספות רגישות וסלקטיביות, מהירות וחסכון, שכן ניטור כולל ניתוח סדרתי. אפשרות HPLC על עמודים קצרים וקטנים עומדת בדרישות אלו במידה רבה. באמצעות שיטה זו, המחברים פיתחו ואישרו שיטות לניטור בנזו [א] פירן בשלוש סביבות טבעיות: אירוסול, כיסוי שלג ומים עיליים. הטכניקות מתאפיינות ב: הכנת דגימה אחידה פשוטה, הכוללת מיצוי PAH עם ממסים אורגניים וריכוז התמצית, הכנסת התמצית המרוכזת ישירות לעמוד הכרומטוגרפי, שימוש בזיהוי פוטומטרי רב-גל באזור ה-UV של ספקטרום, זיהוי פסגות PAH בכרומטוגרמות באמצעות שני פרמטרים, זמן שמירה ויחס ספקטרלי ... השגיאה הכוללת אינה עולה על 10% בקביעת בנזו [א] פירן באירוסול בטווח ריכוזים שבין 0.3 ל-450 ננוגרם / מ"ר, במים עיליים בטווח ריכוז בין 10 ל-1000 ננוגרם לליטר, בכיסוי השלג ב טווח צפיפות פני השטח מ 0.5 עד 50 מיקרוגרם / מ"ר. במקרה של קביעה בו-זמנית של PAH עדיפות (עד 12 תרכובות) ורישום של פסגות לא הומוגניות של אנליטים, מוצע להפריד מחדש את התמצית עם שינוי בסלקטיביות של הפאזה הניידת, אורך גל הזיהוי וטמפרטורת העמודה, תוך התחשבות במאפיינים הפרטניים של ה-PAH שנקבע.

1 ... איכות האוויר בסביבה. ריכוז המוני של בנזו [א] פירן. טכניקת מדידת HPLC. תעודת אישור MVI מס' 01-2000.

2 ... איכות השפכים העיליים והמטופלים. ריכוז המוני של בנזו [א] פירן. טכניקת מדידת HPLC. תעודת אישור MVI מס' 01-2001.

3 ... איכות שלג. ריכוז המוני של בנזו [א] פירן. טכניקת מדידת HPLC. תעודת אישור MVI מס' 02-2001.

הסרת אנילין מתמיסות מימיות באמצעות הפחתת פסולת אלומותרמית של אבנית נחושת מגולגלת

הבעיה של סילוק פחמימנים ממי שפכים היא משימה דחופה. בתעשיות כימיות, פטרוכימיות ואחרות, נוצר אנילין ונגזרותיו, שהם חומרים רעילים. אנילין הוא חומר רעיל מאוד, מגבלת הריכוז המקסימלית היא 0.1 מ"ג / מ"ר. אנילין ונגזרותיו מסיסים במים ולכן לא ניתן להסירם באמצעות שקיעת כוח הכבידה.

אחת השיטות הטובות ביותר לטיהור שפכים ממזהמים אורגניים היא שימוש בחומרי ספיגה אנאורגניים ואורגניים המסוגלים להתחדש (אלומינוסיליקטים, חרסיות מותאמות, עץ, סיבים וכו') ואינם מסוגלים להתחדש (פחם פעיל, חומרים פולימריים מאקרו-פוריים וכו'). . ).

סופחים מחודשים יכולים להסיר מהמים חומרים אורגניים בעלי קוטביות שונה. החיפוש אחר סופחים יעילים הוא משימה דחופה.

דוח זה מציג את תוצאות מחקר בתחום היישום של אבנית נחושת מגולגלת של מפעל הכבלים של ירוואן (OPMOERKZ) כסופחי אנילין.

מחקרים כרומטוגרפיים בוצעו על כרומטוגרף HPLC / כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים / מערכות (Waters 486 - גלאי, Waters 600S - בקר, Waters 626 - משאבה), על עמודה בגודל 250X4 מ"מ מלאה בחומרי הספיגה הנבדקים, הניידת. קצב פאזה 1 מ"ל / מ"ר / פאזה ניידת הם הממיסים שאנו חוקרים /, הגלאי הוא UV-254. אנליזה ספקטרוסקופית UV בוצעה על ספקטרופוטומטר Specord-50, הספקטרום התקבל באמצעות תוכנת המחשב ASPECT PLUS.

לנפחים מסוימים של אנילין במים הוספו מנות סופגים ששוקלו במדויק, שריכוזיהם ההתחלתיים היו מגוונים. התערובת נערעה היטב במשך 6 שעות. לאחר מכן הושארה הדגימה להתייצב. הספיחה מסתיימת כמעט תוך 48 שעות. כמות האנילין המשקע נקבעה על ידי ניתוח UV ספקטרופוטומטרי ורפרקטומטרי.

ראשית, תכונות הספיחה של OPMOErKZ נחקרו כאשר אנילין הוסר מתמיסה בפחמן טטרכלוריד. התברר כי אנילין סופג את הסורבנט 3 הטוב מכולם (טבלה).

כמו כן בוצעו מדידות לתמיסות מימיות של אנילין בריכוזים של 0.01-0.0001 מול/ליטר. הטבלה מציגה נתונים עבור פתרון 0.01 M.

ספיגת אנילין על ידי סופגים שונים מתמיסה מימית של 0.01 M של אנילין ב-20 מעלות צלזיוס

בעבר, נמצא כי הספיחה עולה בטווח הריכוזים שצוין ותלויה באופן ליניארי במקדם השבירה. כמות האנילין נקבעה מהקשר הגרפי "מקדם שבירה - ריכוז מולרי" ותוקנה על ידי נתוני כרומטוגרפיית נוזלים וניתוח ספקטרלי UV כאחד.

סורבנט 3 הוא הפעיל ביותר לתמיסות מימיות, כמות המזהם הנספג חושבה כהפרש בין כמות המזהם הכוללת שנוסף לתמיסה הראשונית לשאריתו בתמיסה הסופית.

שיטות לקביעת PAH באובייקטים סביבתיים

בדרך כלל, נעשה שימוש בשיטות כרומטוגרפיה גז (GC) וכרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC) לקביעת PAHs. הפרדה של 16 ה-PAH העיקריים, המספיקה לניתוח כמותי, מושגת על ידי שימוש בעמודות נימיות בכרומטוגרפיה של גז, או בעמודות בעלות ביצועים גבוהים המשמשים ב-HPLC. יש לזכור שעמודה שמפרידה היטב בין תערובות הכיול של שישה עשר PAHs אינה מבטיחה שהן ייפרדו היטב גם על רקע התרכובות האורגניות הנלוות בדגימות הבדיקה.

על מנת לפשט את הניתוח, כמו גם להשיג איכות גבוהה של התוצאות המתקבלות, רוב ההליכים האנליטיים מכילים את השלב של בידוד ראשוני (הפרדה) של PAHs מקבוצות אחרות של תרכובות קשורות בדגימות. טכניקות כרומטוגרפיה נוזל-מוצק או נוזל-נוזל בלחץ נמוך משמשות לרוב למטרה זו תוך שימוש במנגנוני ספיחה כגון סיליקה ג'ל או אלומינה, לעיתים משתמשים במנגנונים מעורבים, כגון ספיחה ואלימינציה באמצעות Sephadex.

השימוש בטיהור מקדים של דגימות מאפשר להימנע מהשפעה של:

תרכובות לא קוטביות לחלוטין כגון פחמימנים אליפטים;

תרכובות בינוניות עד מאוד קוטביות כגון פתאלנים, פנולים, אלכוהולים רב-הידריים, חומצות;

תרכובות במשקל מולקולרי גבוה כגון שרפים.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) משתמשת בעיקר בשני סוגים של גלאים: גלאי פלואומטרי או גלאי ספקטרופוטומטרי עם מערך פוטודיודות. מגבלת הגילוי ל-PAHs בגילוי פלואומטרי נמוכה מאוד, מה שהופך שיטה זו למתאימה במיוחד לקביעת כמויות עקבות של תרכובות פוליארומטיות. עם זאת, גלאים פלואומטריים קלאסיים אינם מספקים כמעט מידע על מבנה המתחם הנבדק. עיצובים מודרניים מאפשרים לתעד ספקטרום פלואורסצנטי האופייניים לתרכובות בודדות, אך הם עדיין לא הפכו נפוצים בפרקטיקה של מדידות שגרתיות. גלאי ספקטרופוטומטרי עם סרגל פוטודיודה (PDL) מאפשר לרשום ספקטרום בליעה בתחום ה-UV והספקטרלי הנראה לעין, ניתן להשתמש בספקטרים ​​אלו לזיהוי. מידע דומה ניתן לקבל באמצעות גלאי סריקה מהירים.

בעת בחירת טכניקה אנליטית להפרדה, זיהוי וניתוח כמותי של ה-PAHs המוזכרים, יש לקחת בחשבון את התנאים הבאים:

רמת התכולה שנקבעה בדגימות הבדיקה;

מספר החומרים הקשורים;

הליך אנליטי בשימוש (טכניקת מדידה);

יכולות של ציוד סדרתי.

פיתוח שיטה לקביעת יסודות אדמה אלקליין ומגנזיום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים יוניים

פיתוח ושיפור שיטות המאפשרות פתרון בעיות של ניתוח מים מהווה בעיה חשובה בכימיה אנליטית. הפיתוח של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בלחץ גבוה עורר התפתחות של כיוון חדש בכרומטוגרפיה של חילופי יונים, מה שנקרא כרומטוגרפיית יונים. הסינתזה של סופגים עבור כרומטוגרפיה יונים קשה, מכיוון שיש דרישות רבות עבורם. בשל היעדר מחליפי קטונים יעילים מאוד זמינים מסחרית, נעשה שימוש בפאזה הפוכה שונה דינמית, שעבורו סונתז חומר משנה: N-hexadecyl-N-decanoyl-paraminobenoylsulfonic acid ethyl-diisopropylammonium (DHDASK), שבו אמין הידרופובי המכיל SO 3 - קבוצה, מסוגלת להחליף קטונים. לאחר העברת תמיסת המשנה, הספיגה ב-l = 260 ננומטר הגיעה ל-6.4 יחידות של צפיפות אופטית (° E) עם רמה. קיבולת חילופי היונים המחושבת היא 15.65 מיקרומול. מכיוון שהקטיונים של יסודות אדמה אלקליין ומגנזיום אינם סופגים באזור ה-UV של הספקטרום, נעשה שימוש בזיהוי UV עקיף באמצעות חומר הספיגה המסונתז לספוג UV 1,4-dipyridinium butane bromide (DPB bromide). מכיוון שיוני הלוגן הורסים את חלקי הפלדה של העמוד, יון הברומיד של 1,4-דיפירידיניום בוטאן הוחלף ביון אצטט. כאשר העמודה נשטפת עם eluent, הנגדיון המשנה, ethyldiisopropylammonium, מוחלף ביון 1,4-dipyridiniumbutane סופג UV. הפרדת קטיונים בוצעה באורך הגל האופטימלי l = 260 ננומטר בקנה מידה של 0.4 A במצב "קיפול קנה מידה"; הקוטביות של המקליט הייתה הפוכה. ההפרדה של כל הקטיונים שנחקרו הושגה על ידי החדרת תוסף מורכב, חומצה אוקסלית. גבולות הזיהוי עבור Mg 2+, Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+ הם 8 מיקרוגרם לליטר; 16 מיקרוגרם לליטר; 34 מיקרוגרם לליטר; 72 מיקרוגרם לליטר, בהתאמה. בתנאים שנבחרו, נותחו מי ברז, שתכולת Ca 2+ בהם היא 10.6 +1.9 מ"ג-יון לליטר, Mg 2+ -2.5 + מ"ג-יון לליטר. שגיאת השחזור אינה עולה על -2.2% עבור Ca 2+ ו-1.4% עבור Mg 2+.

ניתוח מתחמי קדמיום בסביבה

כדי לחקור את מנגנוני הנדידה של מתכות כבדות בביוספרה, יש צורך בנתונים על הצורות הכימיות של קיומן של מתכות בטבע. קשיים בניתוח תרכובות של אחת המתכות הרעילות ביותר - קדמיום - קשורים לעובדה שהוא יוצר קומפלקסים שבירים, וכאשר מנסים לבודד אותם, שיווי משקל טבעי מעוותים. בעבודה זו נחקרו תרכובות קדמיום בקרקע ובצמחים בטכניקה המבוססת על הפרדה כרומטוגרפית של תמציות עם זיהוי לאחר מכן של הרכיבים בניתוח כימי. גישה זו אפשרה לא רק לזהות את הצורות הכימיות של קדמיום, אלא גם להתחקות אחר התמורות שלהן בעצמים סביבתיים.

קבוצות OH של פחמימות ופוליפנולים (כולל פלבנואידים), C = O, פוספטים, NH 2, NO 2, קבוצות SH מתואמות עם קדמיום באובייקטים של הביוספרה. למטרות מחקר זה, הורכבה קבוצה של ליגנים מודלים המייצגים מחלקות אלו של תרכובות. האינטראקציה של ליגנדים מודלים עם מלחי קדמיום מסיסים במים נחקרה על ידי ספקטרוסקופיה UV ו-HPLC.

כדי לבודד תרכובות קדמיום, השתמשנו במיצוי עם ממסים שנבחרו במיוחד (לא יוצרים קומפלקסים עם Cd). אז אפשר להפריד קדמיום מכל המתכות הכבדות, למעט האנלוג הכימי הקרוב שלו - אבץ. פסגות המכילות קדמיום ואבץ בכרומטוגרמות של התמציות שהתקבלו זוהו על ידי קשירת מתכות בצורת הדיתיזונטים שלהן. להפרדה מאבץ, נעשה שימוש בהבדל ביציבות של קומפלקסים Cd ו-Zn ב-pH 6-8. תרכובות ה-Cd המבודדות זוהו על ידי HPLC עם שינוי ב-pH במהלך אלוציה. בוצע ניתוח של תרכובות הקדמיום עם מרכיבי קרקע ורקמות צמחים, וזוהו החומרים שמייצרים צמחים בתגובה לעלייה בצריכת הקדמיום מהקרקע. הוכח כי פלבנואידים, במיוחד טריצין, הם חומרי הגנה בדגנים, נגזרות אלקוקסי של ציסטאין בקטניות, וגם פוליפנולים ותיולים בצמחים מצליבים.

פרק 4. ציוד HPLC

סִדרָה ACCELA

כרומטוגרף הנוזל החדש ACCELA בעל ביצועים גבוהים במיוחד מסוגל לפעול בטווח הרחב ביותר של קצבי זרימה ולחצים, לספק גם הפרדת HPLC טיפוסית על עמודות קונבנציונליות וגם הפרדה מהירה ויעילה במיוחד על עמודות עם גודל חלקיקים סופג של פחות מ-2 מיקרומטר בלחצים גבוהים במיוחד (מעל 1000 אטמוספירה).

המערכת כוללת משאבת כניסת שיפוע רבעונית המסוגלת ללחוץ מעל 1000 בר ועם נפח אחיזה של 65 μl בלבד להפרדה כרומטוגרפית במהירות גבוהה. דגימה אוטומטית ACCELAמסוגל לפעול במחזור הזרקת דגימה של 30 שניות ומספק את יכולת ההזרקה הגבוהה ביותר. גלאי מערך דיודות Accela PDAעם נפח תא זרימה ממוזער (2 μL) מותאם למצב כרומטוגרפיה מהיר, משתמש בטכנולוגיית LightPipe המוגנת בפטנט ושומר על צורת השיא הסימטרית המובטחת על ידי שימוש במערכת כרומטוגרפית ועמודות ללא רבב.

המערכת משתלבת בצורה מושלמת עם ספקטרומטרי מסה ליצירת מערכות HPLC/MS החזקות והטובות ביותר הקיימות בעולם.

עמודות UHP בגודל גרגר של 1.9 מיקרומטר זמינות מ-Thermo Electron לכל יישום

סִדרָה TSP

עקרון העיצוב המודולרי של התקני HPLC מאפשר ללקוח להשלים בצורה גמישה ציוד לפתרון כל משימות אנליטיות, ואם הם משתנים, ניתן לשנות אותו במהירות ובחסכוניות. המגוון הרחב של המודולים כולל משאבות החל משיפוע איזוקרטי ועד לארבעה רכיבים, מעמודה מיקרו עד חצי הכנה, כל הגלאים הזמינים, מערכות הזרקת דגימות ממזרקים ידניים ועד דגימות אוטומטיות עם כל יכולת מניפולציה של דגימות, תוכנה רבת עוצמה לעיבוד תוצאות המדידה ושליטה בכל מודולי מערכת. כל המודולים מאושרים על פי CSA, TUF/GS, FCC (EMI), VDE (EMI), ISO-9000, הם קומפקטיים, בעלי עיצוב מודרני, קלים לתפעול, מצוידים בתצוגה מובנית ועם תצוגה עצמית. -מערכת אבחון, מאפשרת לך ליצור ולשמור פרמטרים של שיטות משימה. הם עומדים בקריטריונים של "נהלי מעבדה טובים" (GLP) והם רשומים במרשם מכשירי המדידה של הפדרציה הרוסית. דוחות מדידה מונפקים בהתאם לפרמקופיות של אנגליה, ארה"ב, גרמניה וצרפת.

מערכות מודולריות של TSP מאופיינות באמינות וביציבות תפעולית הגבוהה ביותר.

שילוב המודולים מספק לאנליסט את כל היתרונות של מערכת אינטגרלית מחד וגמישות מערכת מודולרית מאידך. בכל תחום יישום של כרומטוגרפיה נוזלית ביעילות גבוהה (HPLC) - פרמקולוגיה, ביוטכנולוגיה, ניתוח סביבתי, ניתוח קליני, ניתוח מוצרי מזוןומשקאות, ניתוח של מוצרים פטרוכימיים וכימיים - מכשיר זה לא היה בשימוש, הוא תמיד מוגדר בצורה אופטימלית על מנת לעמוד בדרישות הגבוהות ביותר.

הן מערכות מחקר והן מערכות שגרתיות בעלות ביצועים גבוהים מספקות:

הסרת גז ממסים יעילה במיוחד

יכולת להתמודד עם כמויות דגימות קטנות וקטנות במיוחד

הרגישות הגבוהה ביותר, הן עם גלאי UV / VIS והן עם מערך דיודות (עם טכנולוגיית LightPipe המפורסמת עם אורך נתיב אופטי של 1 או 5 ס"מ אופציונלי)

עבודה עם עמודות שונות

דיוק הכמות הגבוה ביותר

אפשרות לעבודה אוטומטית בנפחי דגימה שונים

שגיאת זמני שמירה rms פחות מ-0.3%

טביעת רגל מינימלית של המערכת

אמינות ויציבות גבוהה ביותר של פרמטרים.

משאבת מודד LC- משאבת HPLC עם יכולת השחזור הטובה ביותר בזמן האחזקה של כל משאבות השיפוע הארבע-כיווניות הזמינות בעולם. מסיר ואקום משולב עם ארבעה ערוצים ומבולם פעימה מספקים יציבות בסיס מצוינת עבור רגישות ודיוק כמותיות מירבית.

הדגימה האוטומטית מספקת את ביצועי הניתוח והגמישות הגבוהים ביותר. מגוון רחב של מגשי דגימות - מבקבוקונים סטנדרטיים ועד 96 - ומיקרו-צלחות עם 384 בארות - מכסים את הצרכים של כמעט כל היישומים. הטכנולוגיה החדשה מספקת הזרקת דגימה כמעט ללא אובדן, כמעט 5 μL של דגימה מוזרקים עם דגימה אוטומטית מנפח דגימה כולל של 5 μL.

מוֹדֵד

גלאי UV / Vis ו-PDA (גלאי מערך דיודות)

מודד UV / Vis- גלאי UV/אור נראה באורך גל משתנה הוא שילוב של חסכון ואמינות עם הרגישות הגבוהה ביותר של טכנולוגיית LightPipe. מבחר רחב של תאי זרימה הופך את הגלאי הזה לרב-תכליתי עבור כל היישומים, מכרומטוגרפיה נימית או מיקרו-עמודה ועד חצי הכנה והכנה.

מחשב כף יד מודדהגלאי הוא הרגיש ביותר מבין כל גלאי ה-HPLC של מערך הדיודות. אופטיקה עם מקור שתי מנורות מכסה בצורה חלקה את כל טווח אורכי הגל בין 190 ל-800 ננומטר. מעצב קרן האור בסיבים אופטיים מספק רזולוציה אופטית מעולה מבלי להקריב את הרגישות.

מודד RIגלאי רפרקטומטרי עם קובט תרמוסטט בנפח מינימלי עם שליטה אלקטרונית מלאה ממחשב.

מודד FLגלאי סריקה פלואורומטרי בעל הרגישות הגבוהה ביותר ויכולת זיהוי פלואורסצנטיות, כימילומיננסצנטיות וזרחניות.

מגוון רחב של דגימות אוטומטיות מאפשר לך לעבוד הן עם בקבוקונים קונבנציונליים והן עם לוחות עם 96 מצבים, בשימוש נרחב בביוכימיה ו פרקטיקה קלינית... העבודה איתם מתאפשרת על ידי שימוש בצלחות דומות להכנת דגימות בשיטה של ​​מיצוי פאזה מוצקה.

מפעיל חשמלי 400, לולאת Valco (20 µl - סטנדרטי) עם אפשרות למילוי חלקי.

קרוסלה 96 דוגמאות.

הנעה חשמלית, תנור עמוד, לולאת Valco (100 μL - סטנדרטי) עם אפשרות מילוי חלקי מצב AutoMix להכנת דגימה. קרוסלה לדוגמה: 84 x 2 מ"ל (דגימות) + 3x 10 מ"ל (ריאגנטים). תרמוסטט עמודים מובנה. 420

דוגם אוטומטי בלולאה לעבודת מחקר עם יכולת עבודה במצבי מילוי מלא, חלקי והזרקת דגימה במיקרוליטר. מגוון רחב של קרוסלות (סטנדרטי - 96 דוגמאות).

דגימה אוטומטית של טאבלטים לעבודה עם טאבלטים של 96 ו-384 מצבים. הזרקת דגימה ללולאה בלחץ, אפשרות להזרקת דגימות פחות מ-1 μL. אפשרות להתקנת מזין שטוח. HPLC

יצרנים גדולים של ציוד HPLC

· Waters - כרומטוגרפיה סופר ביצועים, ספקטרומטריית מסה, עמודות, מיצוי פאזה מוצקה;

Varian, Inc. - כרומטוגרפים ועמודות, אביזרים למיצוי פאזה מוצקה;

Agilent Technologies - כרומטוגרפים ועמודים;

· Hypersil - עמודים וסופגים.

Merck KGaA - לוחות TLC ואביזרים ל-TLC, עמודים, סופגים, פאזות ניידות ל-HPLC, אביזרים למיצוי פאזה מוצקה

· דיונקס - ציוד ועמודים ל-HPLC, במיוחד לכרומטוגרפיית יונים.

סִפְרוּת

1.Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. כימיה אנליטית. בשני ספרים: ספר 1 - מ .: כימיה, 1990, -480.

1. Pilipenko A.T., Pyatnitsky I.V. כימיה אנליטית. בשני ספרים: ספר 2 - מ .: כימיה, 1990, -480.

2. Vasil'ev V.P. כימיה אנליטית. בעוד שעתיים, חלק 2. שיטות ניתוח פיזיקוכימיות: ספר לימוד. עבור חימקו - טכנול. מוּמחֶה. אוניברסיטאות. - מ .: גבוה יותר. shk., 1989. - 384p.

3. חומרים הידרוכימיים. כרך 100. שיטות ואמצעים טכניים לניטור תפעולי של איכות המים העיליים. L .: Gidrometeo-Izdat, 1991 .-- 200s.

4. לוריא יו.יו. כימיה אנליטית של שפכים תעשייתיים / Yu.Yu. לוריא; מ .: חימיה, 1984 .-- 448 עמ'.

5. Ewing G. שיטות אינסטרומנטליות של ניתוח כימי / פר. מאנגלית מ .: מיר, 1989 .-- 348 עמ'.

6. Gorelik D.O., Konopelko L.A., Pankov E.D. ניטור סביבתי. ב-2 כרכים. SPb .: חג המולד. 2000 .-- 260 עמ'.

7. Aivazov B.V. מבוא לכרומטוגרפיה. מ.: גבוה יותר. ש.ק., 1983 .-- 450 עמ'.

8. גולדברג K.A., Vigdergauz M.S. מבוא לכרומטוגרפיית גז. מ .: כימיה, 1990 .-- 329 עמ'.

9. Stolyarov B.V. וחב' // כרומטוגרפיה מעשית של גז ונוזל. SPb .: SPbGU, 1998. - עמ' 81.

11. Gorshkov A.G., Marinaite I.I. HPLC - שיטה לניטור PAH באובייקטים סביבתיים

12. Torosyan G.O., Martirosyan V.A., Aleksanyan A.R., Zakaryan M.O. הסרת אנילין מתמיסות מימיות באמצעות הפחתת פסולת אלונותרמית של אבנית נחושת מגולגלת

13. ל.א. טורקינה, ג.נ. Koroleva פיתוח שיטה לקביעת יסודות אדמה אלקליין ומגנזיום על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים יוניים

14. Dultseva G.G., Dubtsova Yu.Yu., Skubnevskaya G.I. ניתוח מתחמי קדמיום בסביבה

יישום

קביעת CLOMAZONE במים על ידי שיטות כרומטוגרפיות

הוראות מתודולוגיות MUK 4.1.1415-03

1. הוכן על ידי: פדרל מרכז מדעיהיגיינה אותם. F.F.

אריסמן; האקדמיה החקלאית של מוסקבה. ק.א.

Timiryazev; בהשתתפות המחלקה לפיקוח תברואתי ואפידמיולוגי של משרד הבריאות של רוסיה. מפתחי השיטה מפורטים בסוף.

3. מאושר על ידי רופא תברואתי המדינה הראשי

מהפדרציה הרוסית, סגן שר הבריאות הראשון של הפדרציה הרוסית, Acad. RAMS G.G. אונישצ'נקו 24 ביוני 2003

5. הוצג לראשונה.

1. חלק מבוא

יצרן: FMS (ארה"ב).

שם מסחרי: COMMAND.

חומר פעיל: קלוזון.

2-(2-כלורובנזיל)-4,4-דימתיל-3-איזוקסאלידין-3-און (IUPAC)

נוזל צמיג חום בהיר.

נקודת התכה: 25 -C.

נקודת רתיחה: 275 -C.

לחץ אדים ב-25 -C: 19.2 MPa.

מקדם החלוקה n-אוקטנול / מים: K logP = 2.5.

בואו נתמוסס היטב באצטון, הקסאן, אתנול, מתנול,

כלורופורם, דיכלורומתאן ואצטוניטריל; מסיסות במים -

1.10 גרם/סמ"ק dm. יציב בטמפרטורת החדר לפחות שנתיים, ב-50 -C - לפחות 3 חודשים.

מאפיין טוקסיקולוגי קצר: אוראלי חריף

רעילות (LD) עבור חולדות - 1369 - 2077 מ"ג / ק"ג; עור חריף

רעילות (LD) עבור חולדות - יותר מ 2000 מ"ג / ק"ג; חַד

רעילות בשאיפה (LC) לחולדות - 4.8 מ"ג לקוב. dm (4 שעות).

תקנים היגייניים. MPC במים - 0.02 מ"ג לקוב. dm.

היקף התרופה. Clomazone הוא קוטל עשבים סלקטיבי המשמש למאבק בדגנים ובעשבים דו-פסיגיים בפולי סויה ואורז עם יישום טרום-התעוררות או טרום זריעה.

2. שיטה לקביעת clomazone במים

שיטות כרומטוגרפיות

2.1. הוראות בסיסיות

2.1.1. עקרון השיטה

הטכניקה מבוססת על מיצוי של clomazone מהדגימה המנותחת עם הקסאן, ריכוז התמצית וקביעה כמותית לאחר מכן בשיטות חלופיות:

כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים (HPLC) עם

גלאי UV, כרומטוגרפיה נוזלית גז (GLC) עם גלאי קצב רקומבינציה קבוע או כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC). הכימות מתבצע בשיטת הכיול המוחלט.

2.1.2. סלקטיביות של שיטה

בתנאים המוצעים, השיטה ספציפית בנוכחות מזהמים סביבתיים גלובליים: נגזרות כלור של ציקלופרפינים (איזומרים HCH), תרכובות דיפניל (DDT ונגזרותיו), מטבוליטים שלהן - בננים ופנולים פולי-כלוריים, וכן בנוכחות של סודיום טריכלורואצטט, שניתן להשתמש בו על יבולים כקוטל עשבים.

2.1.3. מאפיינים מטרולוגיים של השיטה (P = 0.95)

ריאגנטים, פתרונות וחומרים

Clomazone עם התוכן של d.v. 99.8%

(FMS, ארה"ב)

חנקן, או GOST 9293-79

מי אמוניה, 25%, h GOST 1277-81

אצטון, h GOST 2603-79

n-Hexane, h GOST 2603-79

מי חמצן, תמיסה מימית 30% GOST 10929-77

אלכוהול איזופרופיל, דרגת מגיב TU 6-09-402-75

חומצה גופרתית, טהורה מבחינה כימית GOST 4203-77

חומצה הידרוכלורית (חומצה הידרוכלורית), דרגת מגיב GOST 3118-77

אלכוהול מתיל, דרגת מגיב GOST

נתרן הידרוקסיד, דרגת מגיב, תמיסה מימית 25% GOST 4323-77

נתרן גופרתי נטול מים, דרגת מגיב GOST 1277-81

חנקתי כסף, דרגת מגיב GOST 1277-81

2-פנוקסימתנול, h TU 6-09-3688-76

Chromaton N-AW-DMCS (0.16 - 0.20 מ"מ)

עם 5% SE-30, Hemapol, צ'כיה

Chromaton N-AW-DMCS (0.16 - 0.20 מ"מ) s 1.5

ОV-17 + 1.95% QF-1, Hemapol, צ'כיה

לוחות עבור HPTLC (ברית המועצות)

לוחות "Kieselgel 60 F-254" (גרמניה)

תקליטים "Silufol" צ'כיה

מסנני נייר סרט לבן, ללא אפר ושטוף מראש עם הקסאן TU 6-09-2678-77

2.3. מכשירים, מכשירים, כלים

כרומטוגרף נוזלי מיליכרום

עם גלאי אולטרה סגול

עמוד כרומטוגרפי פלדה,

אורך 64 מ"מ, קוטר פנימי 2 מ"מ,

במילוי סילאסורב 600, גודל גרגר 5 מיקרון

סדרת כרומטוגרף גז "צבע" או

דומה, מצויד בגלאי קבוע

קצב ריקומבינציה (RPR) עם הגבלה

זיהוי עבור לינדן 4 x 10 גרם / סמ"ק. ס"מ

טור כרומטוגרפי זכוכית, אורך

1 או 2 מ', קוטר פנימי 2 - 3 מ"מ

מזרק מיקרו מסוג MSh-10 עם קיבולת של 10 μl TU 5E2-833-024

מנגנון ניעור, סוג AVU-6s TU 64-1-2851-78

מי אמבטיה TU 64-1-2850-76

איזון אנליטי, סוג VLA-200 GOST 34104-80E

תא כרומטוגרפי GOST 10565-74

משאבת סילון מים GOST 10696-75

מקרין כספית-קוורץ OKN-11 TU 64-1-1618-77

מרססי זכוכית GOST 10391-74

מאייד ואקום רוטרי IR-1M

או TU דומה 25-11-917-76

התקנת מדחס TU 64-1-2985-78

ארון ייבוש TU 64-1-1411-76E

משפכי הפרדה GOST 3613-75

צלוחיות נפח, עם קיבולת של 100 מ"ל GOST 1770-74

גלילי מדידה עם קיבולת של 10, 50 מ"ל GOST 1770-74E

צלוחיות בצורת אגס עם חתך דק,

עם קיבולת של 100 מ"ל GOST 10394-72

צלוחיות חרוטיות, בקיבולת 100 מ"ל GOST 22524-77

צינורות צנטריפוגה, GOST נפחי 25336-82E

פיפטות עם קיבולת של 0.1, 1, 2, 5 ו-10 מ"ל GOST 20292-74

משפכים, כימיים, חרוטיים, קוטר

34 - 40 מ"מ GOST 25336-82E

2.4. בחירת דגימה

הדגימה, האחסון והכנת הדגימות מתבצעות בהתאם

"כללים מאוחדים לדגימת מוצרים חקלאיים, מוצרי מזון וחפצים סביבתיים לקביעת כמויות עקבות של חומרי הדברה", שאושרו במסגרת N 2051-79 מיום 21.08.79

ניתן לשמור את הדוגמאות שנאספו במקרר עד 5 ימים. לפני הניתוח, מים (אם מרחפים) מסוננים דרך מסנן נייר רופף.

2.5. הכנה להכרעה

2.5.1. שיטת HPLC

2.5.1.1. הכנת שלב נייד עבור HPLC

בבקבוק נפח עם קיבולת של 100 מ"ל, 5 מ"ל איזופופאנול ו-5 מ"ל מתנול מונחים עם פיפטה, מוסיפים לסימון עם הקסאן, מערבבים, מסננים.

2.5.1.2. מיזוג עמודות

שטפו את עמודת HPLC עם הקסאן-מתנול-איזופרופנול (90: 5: 5 v / v) למשך 30 דקות. בקצב הזנת ממס של 100 μl / דקה.

2.5.2. שיטת GLC. הכנה ומיזוג עמודות

האריזה המוגמרת (5% SE-30 על Chromaton N-AW-DMCS) נמזגת לעמוד זכוכית, אטומה בוואקום, העמוד מותקן בתרמוסטט כרומטוגרף ללא חיבור לגלאי, ומתייצב בזרימת חנקן בשעה טמפרטורה של 250 -C למשך 10 - 12 שעות.

2.5.3. שיטת TLC

2.5.3.1. הכנת ריאגנטים מתפתחים

2.5.3.1.1. מפתח ריאגנט N 1

1 גרם חנקתי כסף מומס ב-1 מ"ל מים מזוקקים, 10 מ"ל 2-פנוקסימתנול, 190 מ"ל אצטון, מוסיפים 1 - 2 טיפות מי חמצן, מערבבים את התמיסה ומעבירים לבקבוק זכוכית כהה.

2.5.3.2.2. מפתח ריאגנט N 2

0.5 גרם חנקתי כסף מומסים ב-5 מ"ל מים מזוקקים בבקבוקון נפח של 100 מ"ל, מוסיפים 10 מ"ל אמוניה מימית 25%, מביאים את התמיסה ל-100 מ"ל עם אצטון, מערבבים ומועברים לבקבוק זכוכית כהה.

2.5.3.2. הכנת השלב הנייד ל-TLC

בבקבוק נפח בנפח 100 מ"ל, מוסיפים 20 מ"ל אצטון ומוסיפים הקסאן לסימון, מערבבים. התערובת מוזגת לתא הכרומטוגרפי בשכבה של לא יותר מ-6 - 8 מ"מ תוך 30 דקות. לפני כרומטוגרפיה.

2.5.4. הכנת פתרונות סטנדרטיים

תמיסה סטנדרטית בסיסית של clomazone בתכולה של 100 מיקרוגרם/מ"ל מוכנה על ידי המסת 0.010 גרם של תכשיר המכיל 99.8% ai בהקסאן בבקבוקון נפח של 100 מ"ל. התמיסה נשמרת במקרר למשך חודש.

פתרונות סטנדרטיים עובדים עם ריכוז של 0.4; 1.0; 2.0; 4.0; 10.0; 20 ו-40.0 מיקרוגרם/מ"ל מוכנים מתמיסת קלומזון סטנדרטית על ידי דילול סדרתי מתאים עם הקסאן.

פתרונות עבודה נשמרים במקרר לא יותר מחודש.

2.5.5. בניית גרף כיול

2.5.5.1. טבלת כיול A (מדידה לפי סעיף 2.7.1, HPLC)

כדי לבנות גרף כיול, 5 μl של תמיסת clomazone עובדת סטנדרטית עם ריכוז של 4.0 מוזרק לתוך מזרק הכרומטוגרף; 10.0; 20.0 ו-40 מיקרוגרם/מ"ל.

2.5.5.2. גרף כיול B (מדידה לפי סעיף 2.7.2, GLC)

כדי לבנות גרף כיול, מוזרק למאייד הכרומטוגרף 5 μl של תמיסת clomazone עובדת סטנדרטית בריכוז של 0.4; 1.0; 2.0; 4.0 ו-10.0.

נלקחות לפחות 5 מדידות מקבילות. מצא את הערך הממוצע של גובה השיא הכרומטוגרפי עבור כל ריכוז. גרף כיול (A או B) משרטט את התלות של גובה השיא הכרומטוגרפי במ"מ בריכוז הקלמזון בתמיסה במיקרוגרם/מ"ל.

2.6. תיאור הגדרה

100 מ"ל מדגימת המים המנותחת מונחים במשפך הפרדה בקיבולת 250 מ"ל, יוצקים פנימה 10 מ"ל מתמיסת נתרן הידרוקסיד מימית 25%, מערבבים ומוסיפים 20 מ"ל של n-הקסאן. המשפך מזועזע במשך 3 דקות, לאחר הפרדת השלבים, יוצקים את שכבת ההקסאן לבקבוק בצורת אגס בקיבולת 100 מ"ל, ומעבירים אותו דרך שכבת נתרן גופרתי נטול מים המונחת במשפך חרוטי על נייר מקופל. לְסַנֵן. מיצוי התרופה מהדגימה המימית חוזרת על עצמה פעמיים נוספות, תוך שימוש ב-20 מ"ל של n-הקסאן כל אחד. תמצית ההקסאן המשולבת מתאדה על מאייד ואקום סיבובי בטמפרטורה של 40 -C כמעט יבשה, השאריות מפוצצות בזרם אוויר או חנקן בטוהר גבוה. השאריות היבשות מומסות ב-0.1 (HPLC, TLC) או 0.25 מ"ל (GLC) n-hexane ומנתחים באחת מהשיטות הכרומטוגרפיות.

2.7. תנאים כרומטוגרפיים

כרומטוגרף נוזלי מיליכרום עם גלאי אולטרה סגול (רוסיה).

עמוד פלדה באורך 64 מ"מ, קוטר פנימי של 2 מ"מ,

במילוי סילאסורב 600, גודל גרגר 5 מיקרון.

טמפרטורת עמודה: טמפרטורת החדר.

שלב נייד: הקסאן-איזופרופנול-מתנול (90:5:5, בנפח).

קצב זרימת השואב: 100 μl/דקה.

אורך גל עבודה: 240 ננומטר.

רגישות: 0.4 יחידות קליטה על הסקאלה.

נפח דגימה מוזרקת: 5 μl.

זמן שחרור Clomazone: כ-6 דקות.

טווח זיהוי ליניארי: 20 - 200 ננוגרם.

דגימות שנותנות פסגות גדולות מהפתרון הסטנדרטי של 40 מיקרוגרם/מ"ל מדוללות בפאזה ניידת HPLC.

כרומטוגרף גז "Tsvet-570" עם גלאי של קצב ריקומבינציה קבוע של יונים.

עמוד זכוכית באורך 1 מ', קוטר פנימי 3 מ"מ, מלא ב-Chromaton N-AW-DMCS עם 5% SE-30 (0.16 - 0.20 מ"מ).

סולם העבודה של האלקטרומטר הוא 64 x 10 10 אוהם.

מהירות הרשמקול היא 200 מ"מ לשעה.

טמפרטורת התנור בעמודה - 190 -C

גלאי - 300 -C

מאייד - 220 -C

קצב זרימת גז נשא (חנקן) - 60 מ"ל/דקה.

נפח הדגימה המוזרקת הוא 5 μl.

זמן השחרור של clomazone הוא 2.5 דקות.

טווח זיהוי ליניארי: 2 - 50 ננוגרם.

דגימות שנותנות פסגות גדולות מהפתרון הסטנדרטי של 10 מיקרוגרם/מ"ל מדוללות בהקסאן.

כדי לשפר את הדיוק של זיהוי הקלמזון בנוכחות גמא-HCH, בעל זמן שמירה קרוב, בדגימה, מוציאים את הקלמזון מהדגימה על ידי טיפול בחומצה גופרתית מרוכזת. ניתוח מחדש של הדגימה מאפשר לקבוע את התרומה של קלוזון לאות הכרומטוגרפי העיקרי.

תמיסת הקסאן בבקבוק המתקבלת לפי סעיף 2.6 כמותית

(או מנה שלו) מוחל על לוחות כרומטוגרפיים "Silufol", "Kieselgel 60F-254" או "צלחות עבור HPTLC". פתרונות סטנדרטיים מיושמים זה לצד זה בנפח המתאים לתוכן של clomazone 1, 2, 5 ו-10 מיקרוגרם. הצלחת ממוקמת בתא כרומטוגרפיה המכיל תערובת n-הקסאן-אצטון (4:1 בנפח). לאחר פיתוח הכרומטוגרמה, הצלחת מוסרת מהתא, מניחים תחת טיוטה עד שהממיסים מתאדים, ואז מטופלים באחד מהריאגנטים המתפתחים ומניחים מתחת למנורת אולטרה סגול למשך 5 דקות. אזור לוקליזציית התרופות בצלחות Silufol, HPTLC ו- Kizelgel 60F-254 מופיע ככתמים אפורים-חומים עם ערכי Rf של 0.35, 0.85 ו-0.43, בהתאמה. כדי לקבוע clomazone על ידי TLC, אתה יכול להשתמש בצלחות "אלוגרם" ו"פוליגרם" (מיוצרת בגרמניה). ערכי Rf של clomazone בצלחות אלה הם 0.37 ו- 0.38, בהתאמה.

3. דרישות בטיחות

יש צורך לשמור על כללי הבטיחות המקובלים בעבודה עם ממיסים אורגניים, חומרים רעילים, מכשירי חימום חשמליים.

4. בקרת שגיאות מדידה

בקרה תפעולית של טעות המדידה ושחזור מתבצעת בהתאם להמלצות MI 2335-95. GSI "בקרת איכות פנימית של תוצאות ניתוח כימי כמותי".

5. מפתחים

Yudina T.V., Fedorova N.E. (FNTSG על שם F.F. Erisman).

אי דוידיוק (UkrNIIGINTOKS, קייב); Kisenko M.A., Demchenko V.F. (המכון לרפואה תעסוקתית של האקדמיה למדעים והאקדמיה למדעי הרפואה של אוקראינה, קייב).

כרומטוגרפיית נוזלים זוהי שיטה להפרדה וניתוח של תערובות מורכבות של חומרים שבהם נוזל משמש כשלב נייד. זה ישים להפרדה של מגוון רחב יותר של חומרים מאשר שיטת כרומטוגרפיית גז. זאת בשל העובדה שרוב החומרים אינם נדיפים, רבים מהם אינם יציבים בטמפרטורות גבוהות (במיוחד תרכובות במשקל מולקולרי גבוה) ומתפרקים כשהם הופכים למצב גזי. הפרדת חומרים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מתבצעת לרוב בטמפרטורת החדר.

המוזרויות של כל סוגי הכרומטוגרפיה הנוזליות נובעות מהעובדה שהפאזה הניידת בה היא נוזל, והספיגה של רכיבים מחולל גז ונוזל מתרחשת בדרכים שונות. אם בכרומטוגרפיה גז הגז הנשא מבצע רק פונקציית הובלה ואינו נספג על ידי הפאזה הנייחת, אזי הפאזה הניידת הנוזלית בכרומטוגרפיה נוזלית היא חומר eluent פעיל, המולקולות שלו יכולות להיספג על ידי הפאזה הנייחת. כאשר עוברים דרך העמוד, על המולקולות של מרכיבי התערובת המנותחת במפלט לעקור את המולקולות של הספסל משכבת ​​פני השטח של הסורבנט, מה שמוביל לירידה באנרגיית האינטראקציה של מולקולות האנליט עם פני השטח של הסורבנט. לכן, ערכי הכרכים שנשמרו V ר, פרופורציונלי לשינוי באנרגיה החופשית של המערכת, פחות בכרומטוגרפיית נוזלים מאשר בכרומטוגרפיה גז, וטווח הליניאריות של איזותרמית הספיחה בכרומטוגרפית נוזלים רחב יותר.

על ידי שימוש בחומרים שונים, ניתן לשנות את פרמטרי השמירה ואת הסלקטיביות של המערכת הכרומטוגרפית. הסלקטיביות בכרומטוגרפיה נוזלית, בניגוד לכרומטוגרפיה גז, נקבעת לא על ידי אחד, אלא על ידי שני גורמים - אופי השלב הנייד (הפלט) והנייח.

לפאזה הניידת הנוזלית יש צפיפות וצמיגות גבוהים יותר מזה הגזי, מקדמי דיפוזיה ד ו 3-4 סדרי גודל נמוך יותר מאשר בגז. זה מוביל להאטה בהעברת המסה בכרומטוגרפיה נוזלית בהשוואה לכרומטוגרפיה גז. המשוואה של ואן דימטר בשל העובדה שהמונח Vאינו ממלא תפקיד בכרומטוגרפיית נוזלים ( ד ו  ד G), השתנתה גם התלות הגרפית של יעילות נעל המהירות הליניארית של הזרימה של השלב הנייד יש את הצורה המוצגת באיור. 1.9.

בגרסה הקלאסית של כרומטוגרפיית עמודת נוזלים, דגימה מנותחת מומסת במפלט מוכנסת לעמודת זכוכית בגובה 1-2 מ', מלאה בחומר סופג בגודל חלקיקים של 100 מיקרומטר וספליט, והמפלט מועבר דרכו. , נטילת חלקים מהמפלט מהעמוד. גרסה זו של כרומטוגרפיה נוזלית עדיין בשימוש במעבדה, אך מכיוון שקצב המעבר של הספסל בהשפעת כוח הכבידה נמוך, הניתוח ממושך.

הגרסה המודרנית של כרומטוגרפיית נוזלים, מה שנקרא HPLC כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, משתמשת בחומרי ספיגה נפחיים ונקבוביים על פני השטח בגודל חלקיקים של 5-10 מיקרומטר, משאבות הזרקה המספקות לחץ במערכת עד 400 אטמוספירה, גלאים רגישים במיוחד. העברת מסה מהירה ויעילות הפרדה גבוהה מאפשרים להשתמש ב-HPLC להפרדה מולקולרית (כרומטוגרפיה של ספיחה נוזלית ומחיצות נוזל-נוזל), להפרדת יונים (כרומטוגרפיה חילופי יונים, יונית, צמד יונים), להפרדת מקרומולקולות (הרחקת גודל). כרומטוגרפיה).

1.3. שמירה וחוזק של הממס

על מנת שהאנליטים יופרדו על העמוד, כאמור לעיל, גורם הקיבולת k "חייב להיות גדול מ-0, כלומר, החומרים חייבים להישמר על ידי הפאזה הנייח, הסורבנט. עם זאת, אסור לגורם הקיבולת גדול מכדי להשיג זמן שחרור מקובל. אם נבחר שלב נייח עבור תערובת נתונה של חומרים, שמחזיק אותם, אז עבודה נוספת על פיתוח שיטה אנליטית מורכבת בבחירת ממס שיספק, באופן אידיאלי, שונה עבור כל הרכיבים, אבל מקובל לא גדול מאוד k ". זה מושג על ידי שינוי חוזק הפליטה של ​​הממס.

במקרה של כרומטוגרפיה של ספיחה על סיליקה ג'ל או אלומינה, ככלל, חוזק הממס הדו-רכיבי (לדוגמה, הקסאן בתוספת איזופרופנול) גדל על ידי הגדלת תכולת הרכיב הקוטבי (איזופרפנול), או ירד על ידי הפחתת תכולת האיזופרופנול. אם תכולת הרכיב הקוטבי הופכת נמוכה מדי (פחות מ-0.1%), יש להחליפו ברכיב חלש יותר בחוזק הפליטה. כך נעשה, החלפת הרכיב הקוטבי או הלא קוטבי באחרים, ובמקרה שמערכת זו אינה מספקת את הסלקטיביות הרצויה ביחס לרכיבים המעניינים בתערובת. בעת בחירת מערכות ממס, נלקחות בחשבון הן המסיסות של מרכיבי התערובת והן סדרת הממיסים האלואוטרופית שנאספה על ידי מחברים שונים.

בערך באותו אופן, חוזק הממס נבחר במקרה של שימוש בפאזות קוטביות מושתלות (ניטריל, אמינו, דיול, ניטרו וכו'), תוך התחשבות אפשרית תגובה כימיתולמעט ממיסים מסוכנים לפאזה (למשל אלדהידים וקטונים לשלב האמין).

במקרה של כרומטוגרפיה הפוכה של פאזה הפוכה, חוזק הממס גדל על ידי הגדלת תכולת המרכיב האורגני (מתנול, אצטוניטריל או THF) במפלט ומופחת על ידי הוספת מים נוספים. אם לא ניתן להשיג את הסלקטיביות הרצויה, השתמש ברכיב אורגני אחר או נסה לשנות אותו באמצעות תוספים שונים (חומצות, ריאגנטים של זוג יונים וכו').

בהפרדות באמצעות כרומטוגרפיה של חילופי יונים, חוזק הממס משתנה על ידי הגדלת או הפחתה של ריכוז תמיסת החיץ או שינוי ה-pH; במקרים מסוימים, נעשה שימוש בשינוי עם חומרים אורגניים.

עם זאת, במיוחד במקרה של תערובות טבעיות וביולוגיות מורכבות, לרוב לא ניתן לבחור את חוזק הממס בצורה כזו שכל מרכיבי הדגימה ייפלטו תוך זמן סביר. לאחר מכן יש לפנות לאליפת שיפוע, כלומר. השתמש בממס, שכוח הפליטה שלו משתנה במהלך הניתוח כך שהוא גדל כל הזמן בהתאם לתוכנית שנקבעה מראש. טכניקה זו מאפשרת להגיע לאלוציה של כל מרכיבי התערובות המורכבות בפרק זמן קצר יחסית והפרדתם לרכיבים בצורה של פסגות צרות.

1.6.1. כרומטוגרפיה של נוזל ספיחה... כרומטוגרפיה נוזלית ספיחה, בהתאם לקוטביות של השלב הנייח והנייד, מחולקת לכרומטוגרפיה רגילה (NPC) ו-Reversed Phase (RPC). ב-NPH, נעשה שימוש בפאזות ניידות קוטביות ובפאזות ניידות לא קוטביות, בשלבים ספיח לא קוטביים של RP ובשלבים ניידים קוטביים, אך בשתי הגרסאות הבחירה של פאזה ניידת היא לרוב חשובה יותר מהבחירה של פאזה נייחת. השלב הנייח חייב לשמור על החומרים להפרדה. השלב הנייד, כלומר הממס, אמור לספק יכולות עמודות משתנות והפרדה יעילה בזמן סביר.

כשלב נייח בכרומטוגרפיית נוזל ספיחה, נעשה שימוש בחומרים נקבוביים מפוזרים דק קוטביים ולא קוטביים עם שטח פנים ספציפי של יותר מ-50 מ"ר לגרם. לחומרים סופחים קוטביים (SiO 2, Al 2 O 3, Florisil וכו') יש קבוצות חומציות חלשות על פני השטח המסוגלות לשמור על חומרים בעלי תכונות בסיסיות. סופחים אלו משמשים בעיקר להפרדה של תרכובות לא-קוטביות ובינוניות-קוטביות. החיסרון שלהן הוא הרגישות הגבוהה שלהן לתכולת המים בחומרים המיושמים. כדי לבטל את החיסרון הזה, סורבנטים קוטביים מטופלים באמינים, דיולים וריאגנטים אחרים, וכתוצאה מכך להשתלת ריאגנטים אלו על פני השטח, שינוי פני השטח ושינוי בסלקטיביות ביחס לאנליטים.

סופחים לא קוטביים (פיח שעבר גרפיט, דיאטומיט, אדמה דיאטומית) אינם סלקטיביים למולקולות קוטביות. כדי להשיג סופחים לא קוטביים, קבוצות לא קוטביות, למשל, alkylsilyl SiR 3, כאשר R הן קבוצות אלקיל C 2 C 22, מושתלות לעתים קרובות על פני השטח, למשל, של סיליקה ג'ל.

השלב הנייד חייב להמיס לחלוטין את המדגם המנותח, בעל צמיגות נמוכה (כדי שמקדמי הדיפוזיה יהיו גדולים מספיק), רצוי שניתן יהיה לבודד ממנו את הרכיבים המופרדים. הוא חייב להיות אינרטי ביחס לחומרים של כל חלקי הכרומטוגרף, בטוח, זול, מתאים לגלאי.

השלבים הניידים המשמשים בכרומטוגרפיה נוזלית נבדלים בעוצמת הפליטה שלהם. חוזק הפליטה של ​​ממס מראה כמה פעמים אנרגיית הספיחה של חומר eluent נתון על סופח נתון גדולה יותר מאנרגיית הספיחה של ממיס שנבחר כסטנדרט, למשל, n-heptane. ממיסים חלשים נספגים בצורה גרועה על ידי השלב הנייח; לכן, מקדמי ההתפלגות של החומרים הנספגים (סורבט) גבוהים. להיפך, ממיסים חזקים נספגים היטב, ולכן מקדמי ההתפלגות של הסורבט נמוכים. הממס הוא חזק יותר, ככל שמסיסות הדגימה המנותחת בו גבוהה יותר, כך האינטראקציה בין הממס לסורבט חזקה יותר.

כדי להבטיח יעילות הפרדה גבוהה על העמוד, יש צורך לבחור פאזה ניידת בעלת קוטביות אופטימלית לתערובת שתופרד בתנאי ההפרדה שנבחרו. בדרך כלל, תחילה נבחר שלב נייח בעל קוטביות קרובה לקוטביות הרכיבים שיש להפריד. ואז השלב הנייד נבחר, מבטיח כי גורם הקיבול ק" התברר בטווח שבין 2 ל-5. אם הקוטביות של הפאזה הניידת קרובה מדי לקוטביות השלב הנייח, זמן ההחזקה של הרכיבים יהיה קצר מדי, ואם הקוטביות של הפאזה הניידת והנייח השלבים שונים מדי, זמן השמירה הופך ארוך מדי.

בבחירת שלבים ניידים, האדם מונחה על ידי מה שנקרא סדרה eluotropic המבוססת על שימוש במדדי קוטביות סניידר ר", המחלק את כל הממיסים לחזק (קוטבי) וחלש (קוטבי חלש ולא קוטבי). סולם הקוטביות מבוסס על מסיסות של חומרים המשמשים כפאזות ניידות בדיוקסאן, ניטרומתאן ואתנול.

טבלה 1.2 מציגה את ערכי מדדי הקוטביות וכוח הפליטה (בהתייחס ל-SiO 2) עבור מספר ממסים המשמשים לרוב כשלבים ניידים בכרומטוגרפיה נוזלית. כאן מצוינים מגבלות השקיפות באורך הגל הקצר של ממסים אלה, מה שמקל על בחירת התנאים לזיהוי רכיבי תערובת.

טבלה 1.2

מאפיינים של ממסים המשמשים בכרומטוגרפיה נוזלית

כרומטוגרפיית נוזלים משתמשת לעתים קרובות לא בממסים בודדים, אלא בתערובות שלהם. לעתים קרובות, תוספות קלות של ממס אחר, במיוחד מים, יגדילו משמעותית את חוזק הפליטה של ​​המפלס.

בעת הפרדת תערובות מרובות רכיבים, ייתכן ששלב נייד אחד כמפלט לא יפריד את כל רכיבי הדגימה בזמן סביר. במקרה זה, נעשה שימוש בשיטה של ​​אלוציה שלבית, או גרדיאנט, שבה נעשה שימוש ברצף יותר ויותר בחומרים חזקים במהלך הכרומטוגרפיה, מה שמאפשר לחלוט חומרים בעלי ריכוז גבוה בזמן קצר יותר.

בכרומטוגרפיה נוזלית, יש כאלה אֶמפִּירִיכללים שימושיים מאוד בבחירת חומר eluent:

 ספיגת תרכובת, ככלל, עולה עם עלייה במספר הקשרים הכפולים וקבוצות ה-OH בה;

 ירידה בספיגה בסדרת התרכובות האורגניות: חומצות  אלכוהולים אלדהידים קטונים אסטרים פחמימנים בלתי רוויים פחמימנים רוויים;

 כרומטוגרפיה של פאזה רגילה משמשת להפרדה בין חומרים בעלי קוטביות שונה והפרדה בין חומרים ממחלקות שונות: הדגימה המנותחת מומסת ונפלטת עם חומר eluent לא קוטבי, תרכובות ממחלקות שונות יוצאות מהעמוד עם סופח קוטבי לזמנים שונים, בעוד זמן ההחזקה של תרכובות בעלות קבוצות תפקודיות שונות עולה עם המעבר מקשרים לא קוטביים לקוטביים חלשים. עבור מולקולות מאוד קוטביות, זמני ההחזקה כל כך ארוכים עד שלא ניתן לבצע ניתוח עם חומר eluent לא קוטבי. כדי לצמצם את זמן ההחזקה של הרכיבים הקוטביים, הם עוברים לחומרים קוטביים;

 בגרסה הפוכה, השלב הנייח (סופח לא קוטבי) סופח חזק יותר את הרכיב הלא קוטבי מחומרים קוטביים, למשל, ממים;

 על ידי הפחתת הקוטביות של eluent על ידי הוספת ממס פחות קוטבי, ניתן להפחית את החזקת הרכיבים.

1.6.2. כרומטוגרפיית נוזל הפצה.בחלוקה או בכרומטוגרפיה של נוזל-נוזל, ההפרדה של מרכיבי הדגימה המנותחת נובעת מהבדלים במקדמי התפלגותם בין שני שלבים נוזליים בלתי ניתנים לערבב, שאחד מהם נייח וממוקם על פני השטח או בנקבוביות של מנשא נייח מוצק, והשני נייד.

מטבעם של כוחות האינטראקציה, הקובעים את ההתפלגות השונה בין שני השלבים של חומרים הנבדלים במבנה הכימי שלהם, כרומטוגרפיית התפלגות דומה לספיחה, כלומר, גם כאן ההפרדה מבוססת על ההבדל בכוחות. של אינטראקציה בין-מולקולרית של מרכיבי המדגם המנותח עם השלבים הנוזליים הנייחים והניידים.

בהתאם לטכניקה, כרומטוגרפיית הפצה, כמו כרומטוגרפיית ספיחה, יכולה להיות עמודה או שטוחה (נייר או שכבה דקה).

כנשאים מוצקים, נעשה שימוש בחומרים אדישים ביחס לממס הנייד ולמרכיבי המדגם המנותח, אך מסוגלים לשמור על הפאזה הנייח על פני השטח ובנקבוביות. לרוב, חומרים קוטביים (צלולוזה, סיליקה ג'ל, עמילן) משמשים כנשאים. שלב נייח - ממס קוטבי, לרוב מים או אלכוהול, מוחל עליהם. במקרה זה, חומרים פחות קוטביים או לא קוטביים (אלכוהולים, אמינים, קטונים, פחמימנים וכו') משמשים כשלבים ניידים. גרסה זו של כרומטוגרפיה מחיצה נקראת שלב רגיל... הוא משמש להפרדת חומרים קוטביים.

הגרסה השנייה של כרומטוגרפיית מחיצות שונה בכך שנשאים לא קוטביים (גומי, פלואורפלסטיים, סיליקה ג'ל הידרופוביה) משמשים כשלב המוצק הנייח, ממיסים לא קוטביים (פחמימנים) משמשים כשלב הנוזלי הנייח, וממיסים קוטביים (אלכוהולים , אלדהידים, קטונים וכו', לעתים קרובות מים). גרסה זו של כרומטוגרפיה מחיצה נקראת שלב הפוךומשמש להפרדת חומרים לא קוטביים.

כדי להשיג הפרדה מיטבית של מרכיבי המדגם המנותח, בחירת השלב הנייד חשובה מאוד. יש לבחור ממסים (שלבים נוזליים ניידים ונייחים) כך שמקדמי ההתפלגות של מרכיבי התערובת יהיו שונים במידה משמעותית. להלן מוצגים לשלבים הנוזליים דרישות:

1) הממיסים המשמשים צריכים להמיס היטב את החומרים שיש להפריד, והמסיסות שלהם בשלב הנייח צריכה להיות גדולה יותר מאשר בשלב הנייד;

2) הממסים המשמשים כשלבים ניידים ונייחים חייבים להיות ניתנים לרוויה הדדית, כלומר, הרכב הממס חייב להיות קבוע במהלך מעברו בעמוד;

3) האינטראקציה של ממיסים המשמשים כשלב הנייד עם השלב הנייח צריכה להיות מינימלית.

לרוב, בכרומטוגרפיה נוזלית מחיצה, לא משתמשים בחומרים בודדים כשלבים נוזליים ניידים, אלא בתערובות שלהם ביחסים שונים. זה מאפשר לווסת את הקוטביות של הפאזה הניידת, לשנות את היחס בין הקוטביות של השלב הנייד והנייח ולהשיג תנאי הפרדה אופטימליים למרכיבים של תערובת מנותחת מסוימת.

חסרון משמעותי של שיטה כרומטוגרפית זו הוא שטיפה מהירה למדי של שלב הנוזל הנייח המיושם מהמנשא. כדי לחסל אותו, הממס המשמש כפאזה ניידת רווי בחומר המשמש כפאזה נוזלית נייח, או שהפאזה הנוזלית הנייחת מיוצבת על ידי השתלתו על הנשא.

סוג של כרומטוגרפיית נוזל מחיצה היא שיטת HPLC בשימוש נרחב.

המערכות הכרומטוגרפיות הנפוצות ביותר הן מערכות בעלות עקרון הרכבה מודולרי. משאבות, מכשירי הסרת גז, גלאים, מחלקים (דוגמים אוטומטיים), תרמוסטטים עמודים, קולטי שברים, יחידות בקרת מערכת כרומטוגרפית והתקני הקלטה מיוצרים כמודולים נפרדים. מגוון רחב של מודולים מאפשר לך לפתור בצורה גמישה משימות אנליטיות שונות, לשנות במהירות את תצורת המערכת במידת הצורך עם עלויות מינימליות. במקביל, מיוצרים גם LCs מונומודוליים (משולבים), שהיתרון העיקרי בהם הוא מזעור בלוקים בודדים והקומפקטיות של המכשיר.

בהתאם לשיטת האלוציה, כרומטוגרפים נוזליים מחולקים לאיזוקרטיים וגרדיאנטים.

תרשים סכמטי של כרומטוגרף איזוקרטי

הפאזה הניידת מהמיכל (1) דרך מסנן הכניסה (9) מסופקת באמצעות משאבת לחץ גבוה מדויקת (2) למערכת הכנסת הדגימה (3) - מזרק ידני או דגימה אוטומטית, ומשם מוזרקת דגימה . לאחר מכן, דרך מסנן ה-in-line (8), המדגם עם זרם הפאזה הנייד נכנס לאלמנט ההפרדה (ים) (4) - דרך עמודת השמירה אל עמודת ההפרדה. לאחר מכן, האלואט נכנס לגלאי (5) ומוסר לתוך מיכל הניקוז (7). כאשר ה-eluate זורם דרך מעגל המדידה של הגלאי, הכרומטוגרמה נרשמת והנתונים מועברים למקליט אנלוגי (מקליט) (6) או מערכת אחרת לאיסוף ועיבוד נתונים כרומטוגרפיים (אינטגרטור או מחשב). בהתאם לעיצוב המודולים הפונקציונליים, ניתן לשלוט במערכת מהמקלדת של מודול הבקרה (בדרך כלל משאבה או בקר מערכת), מהמקלדות של כל אחד ממודולי המערכת, או על ידי תוכנית הבקרה ממחשב אישי.

במקרה של פליטת שיפוע, משתמשים בשני סוגים שונים מהותית של כרומטוגרפים נוזליים. הם נבדלים בנקודת היווצרות שיפוע ההרכב של השלב הנייד.

תכנית של כרומטוגרף שיפוע עם היווצרות שיפוע של הרכב הפאזה הניידת בקו הלחץ הנמוך.

הפאזה הניידת מהמיכלים (1) דרך מסנני הכניסה (9) ומתכנת השיפוע (10) מוזנת על ידי משאבת דיוק בלחץ גבוה (2) למערכת הכנסת המדגם (3) - מזרק ידני או דגימה אוטומטית , שבו הדגימה מוזרקת. שסתומי מתכנת השיפוע נשלטים על ידי יחידת בקרת המערכת (משאבה או בקר) או על ידי תוכנית בקרת PC. מערכות מסוג זה יוצרות גרדיאנטים בינארים, תלת מימדיים וארבע מימדיים. הצורה של פונקציית עיבוד השיפוע תלויה במודול הבקרה הספציפי או בתוכנית הבקרה, כמו גם בפונקציונליות של מודולי הבקרה והבקרה. לאחר מכן, דרך מסנן ה-in-line (8), המדגם עם זרם הפאזה הנייד נכנס לאלמנט ההפרדה (ים) (4) - דרך עמודת השמירה אל עמודת ההפרדה. לאחר מכן, ה-eluate נכנס לגלאי (5) ומוסר לתוך מיכל ההצפה (7). כאשר ה-eluate זורם דרך מעגל המדידה של הגלאי, הכרומטוגרמה נרשמת והנתונים מועברים למקליט אנלוגי (מקליט) (6) או מערכת אחרת לאיסוף ועיבוד נתונים כרומטוגרפיים (אינטגרטור או מחשב). בהתאם לעיצוב המודולים הפונקציונליים, ניתן לשלוט במערכת מהמקלדת של מודול הבקרה (בדרך כלל משאבה או בקר מערכת), או על ידי תוכנית הבקרה ממחשב אישי. אם יחידת הבקרה נשלטת, ניתן לשלוט על הגלאי באופן עצמאי מהמקלדת שלו.

למרות האטרקטיביות לכאורה של מערכות כאלה (הן משתמשות רק במשאבת דיוק בלחץ גבוה אחד), למערכות אלו יש מספר חסרונות, ביניהם העיקרי, אולי, הוא הצורך הקפדני בהסרה יסודית של מרכיבי השלב הנייד אפילו לפני מערבל בלחץ נמוך (תא מתכנת גרדיאנט). זה מתבצע באמצעות מסירי גז מיוחדים. בגלל עובדה זו, העלות שלהם הופכת להיות דומה לסוג אחר של מערכות שיפוע - מערכות עם היווצרות הרכב שיפוע השלב הנייד על קו הלחץ הגבוה.

ההבדל המהותי בין המערכות עם היווצרות הרכב שיפוע השלב הנייד בקו הלחץ הגבוה הוא ערבוב הרכיבים בקו הלחץ הגבוה; מטבע הדברים, בגישה זו, מספר המשאבות המדויקות נקבע על ידי מספר המיכלים לערבוב השלב הנייד. עם גישה זו, הדרישות ליסודיות של הסרת הגז של הרכיבים מופחתות באופן משמעותי.

סכימה של כרומטוגרף שיפוע עם היווצרות שיפוע של הרכב הפאזה הניידת על קו הלחץ הגבוה.

הפאזה הניידת מהמיכלים (1) דרך מסנני הכניסה (9) מוזנת על ידי משאבות דיוק בלחץ גבוה (2 ו-11) דרך מערבל זרימה סטטי או דינמי (10) לתוך מערכת הכנסת המדגם (3) - מדריך מזרק או דגימה אוטומטית, שבה הדגימה מוזרקת. פעולת המשאבות המבוקרות נשלטת על ידי יחידת הבקרה של המערכת (משאבת "מאסטר משאבת" או בקר), או על ידי תוכנית הבקרה של המחשב. במקרה זה, כל המשאבות נשלטות. מערכות מסוג זה יוצרות שיפוע בינארי או תלת מימדי. הצורה של פונקציית עיבוד השיפוע תלויה במודול הבקרה הספציפי או בתוכנית הבקרה, כמו גם בפונקציונליות של מודולי הבקרה והבקרה. לאחר מכן, דרך מסנן ה-in-line (8), המדגם עם זרם הפאזה הנייד נכנס לאלמנט ההפרדה (ים) (4) - דרך עמודת השמירה אל עמודת ההפרדה. לאחר מכן, ה-eluate נכנס לגלאי (5) ומוסר לתוך מיכל ההצפה (7). כאשר ה-eluate זורם דרך מעגל המדידה של הגלאי, הכרומטוגרמה נרשמת והנתונים מועברים למקליט אנלוגי (מקליט) (6) או מערכת אחרת לאיסוף ועיבוד נתונים כרומטוגרפיים (אינטגרטור או מחשב). בהתאם לעיצוב המודולים הפונקציונליים, ניתן לשלוט במערכת מהמקלדת של מודול הבקרה (בדרך כלל משאבה או בקר מערכת), או על ידי תוכנית הבקרה ממחשב אישי. אם יחידת הבקרה נשלטת, ניתן לשלוט על הגלאי באופן עצמאי מהמקלדת שלו.

התוכניות המוצעות מפושטות למדי. המערכות יכולות לכלול התקנים נוספים - תרמוסטט עמודים, מערכות נגזרת פוסט-עמודה, מערכות הכנת דגימות וריכוז דגימות, מחזר ממס, מערכות ממברנות לדיכוי מוליכות רקע (לכרומטוגרפיית יונים), מערכות הגנה נוספות (מסננים, עמודים וכו'. בתרשימים, גם מודולי מד אינם מוצגים בנפרד. ככלל, מכשירים אלה מובנים ביחידות שאיבה. יחידות אלו יכולות לשלב מספר משאבות, משאבה עם מתכנת שיפוע ובקר מערכת משותף. מבנה המערכת תלוי בתצורה שלה ובכל יצרן ספציפי.

סיבוך קיצוני כזה של התמיכה הטכנית של התהליך הכרומטוגרפי מוביל להופעתם של מספר דרישות למאפייני השלב הנייד, אשר נעדרות בכרומטוגרפיה קלאסית עמודה ומישורית. הפאזה הנוזלית חייבת להיות מתאימה לגילוי (להיות שקוף באזור ספקטרלי נתון או בעל מקדם שבירה נמוך, מוליכות חשמלית מסוימת או קבוע דיאלקטרי וכו'), אינרטי לחומרים של חלקי הצינור הכרומטוגרפיים, לא ליצור בועות גז בשסתומי המשאבה ובתא הגלאי, יש זיהומים מכניים.

בכרומטוגרפיה נוזליתמשתמשים בסוגים רבים של משאבות. משאבות פריסטלטיות משמשות לעתים קרובות עבור LC בלחץ נמוך (איור 1).

איור 1 משאבה פריסטלטית MasterFlex הניתנת לתכנות.

ב-HPLC, משאבות בלחץ גבוה משמשות כדי לספק את קצב הזרימה של השלב הנייד דרך העמודה עם הפרמטרים שצוינו.

המאפיינים הטכניים החשובים ביותר של משאבות HPLC הם: טווח זרימה; לחץ עבודה מרבי; שחזור זרימה; טווח הפעימות של אספקת הממס.

לפי אופי אספקת הממס, המשאבות יכולות להיות באספקה ​​קבועה (זרימה) ולחץ קבוע. בעיקרון, עבור עבודה אנליטית, קצב זרימה קבוע משמש, בעת מילוי עמודות - לחץ קבוע.

על פי עקרון הפעולה, משאבות HPLC מחולקות ל מַזרֵק והלאה טוֹבְלָן הדדיות .

משאבות מזרק

המאפיין העיקרי המבחין של משאבות אלו הוא מחזוריות פעולתן, שבקשר אליה נבדלים גם הכרומטוגרפים בהם משתמשים במשאבות אלו בפעולה המחזורית.

אורז. 2. המבנה הבסיסי של משאבת מזרק עבור HPLC.

אורז. 2א. משאבת מזרק.

יחידת הבקרה CU מספקת מתח למנוע D, הקובע את מהירות וכיוון סיבובו. סיבוב המנוע בעזרת תיבת ההילוכים P מומר לתנועת הבוכנה P בתוך הצילינדר D. המשאבה פועלת ב-2 מחזורים. במהלך מחזור המילוי, שסתום K2 נסגר, K1 פתוח, הממס נכנס מהמאגר לתוך הצילינדר C. במצב האספקה, שסתום K1 נסגר, ודרך שסתום K2 נכנס השלב הנייד למכשיר המינון.

משאבות מסוג זה מאופיינות בהיעדר כמעט מוחלט של פעימות של זרימת השלב הנייד במהלך הפעולה.

חסרונות המשאבה:

א) צריכה גדולה של זמן וממס לשטיפה בעת החלפת הממס;

ב) נפח ה-PF מוגבל בנפח המזרק, ומכאן זמן ההפרדה המוגבל;

ג) השעיה של הפרדה במהלך מילוי המשאבה;

ד) מידות ומשקל גדולים תוך הקפדה על זרימה ולחץ גבוהים (צריך מנוע חזק וכוח בוכנה גדול עם שטחו הגדול).

משאבות בוכנה.

אורז. 3. המבנה הבסיסי של משאבת הבוכנה.

עקרון הפעולה.

מנוע D דרך תיבת ההילוכים R מניע את הבוכנה P בתנועה הדדית, נע בראש עובד המשאבה. שסתומים K1 ו-K2 נפתחים כאשר המשאבה נמצאת בשלבי היניקה וההספקה, בהתאמה. הזרימה הנפחית נקבעת על ידי שלושה פרמטרים: קוטר הבוכנה (בדרך כלל 3.13; 5.0; 7.0 מ"מ), משרעת שלה (12-18 מ"מ) ותדירות (התלויה במהירות הסיבוב של המנוע ותיבת ההילוכים).

משאבות מסוג זה מספקות זרימה נפחית קבועה של השלב הנייד למשך זמן רב. לחץ העבודה המרבי הוא 300-500 atm, קצב הזרימה הוא 0.01-10 מ"ל / דקה. יכולת שחזור של הזנה נפחית -0.5%. החיסרון העיקרי הוא שהממס מוזן למערכת בצורה של סדרה של דחפים עוקבים, ולכן יש פעימות לחץ וזרימה (איור 4). זוהי הסיבה העיקרית לרעש המוגבר ולירידה ברגישות של כמעט כל הגלאים המשמשים ב-LC, במיוחד אלו האלקטרוכימיים.

איור 4. אדווה של משאבת הבוכנה.

דרכים להתמודד עם פעימות.

1. יישום מכשירי שיכוך.

מדובר בצינורות ספירלה בעלי פרופיל מיוחד עשוי נירוסטה המחוברים בסדרה או במקביל למערכת שבין המשאבה ליחידת המינון.

אורז. 5. מנחת ספירלה.

הבולם מסתובב כאשר הלחץ בו עולה (האצת מהלך המשאבה). כאשר הלחץ יורד, הוא מתפתל, נפחו יורד, הוא סוחט חלק מהממס, שומר על קצב זרימה קבוע ומפחית פעימות. מנחת כזה עובד היטב בלחץ של 50 אטמוספירות ומעלה.

בלחץ של 5-30 atm, הוא מחליק את הפעימות טוב יותר מנחת אווירעשוי מעמוד (איור 6.). האוויר בעמוד העמום (6x200 מ"מ) נדחס והפעימות נפוחות. האוויר בו מתמוסס תוך 24 שעות.

אורז. 6. מנחת אוויר.

2. השימוש במכשירים אלקטרוניים.

בעת שימוש בחיישן לחץ אלקטרוני, ניתן להשתמש בקריאה של החיישן כדי לשלוט על פעולת המשאבה. ככל שהלחץ יורד, מהירות המנוע עולה ומפצה על ירידת הלחץ. ניתן גם לפצות על נזילות בשסתומים ובחלקי בחפתים. השימוש בבולם אלקטרוני (BPZh-80, KhPZh-1 וכו') מאפשר להפחית את פעימות הלחץ ל-1 atm בלחץ של 100-150 kgf / cm2.

1.6.3. חילופי יונים, כרומטוגרפיה יונית, צמד יונים.השיטות של כרומטוגרפיה של חילופי יונים, יונית וזוג יונים מבוססות על תהליך דינמי של החלפת יונים הקשורים לשלב הנייח ביונים של חומר ההסרה הנכנס לעמוד. המטרה העיקרית של התהליך הכרומטוגרפי היא הפרדה של יונים אנאורגניים או אורגניים מאותו סימן. שימור בסוגים אלה של כרומטוגרפיה נקבע על ידי שינוי באנרגיה החופשית של תגובת חילופי היונים. היחס בין ריכוזי היונים המוחלפים בתמיסה ובשלב הסורב מאופיין בשיווי משקל חילופי יונים. חילופי יונים מורכבים מהעובדה שחלק מהחומרים (מחליפי יונים), כשהם שקועים בתמיסת אלקטרוליטים, סופגים ממנה קטיונים או אניונים, ומשחררים לתמיסה כמות שווה של יונים אחרים עם מטען של אותו סימן. יש חילופי קטיונים בין מחליף קטונים לתמיסה, ובין מחליף אניונים לתמיסה - חילופי אניונים.

מחליפי קטיון הם לרוב חומרים פולימריים בלתי מסיסים מסונתזים במיוחד המכילים קבוצות חומציות יונוגניות במבנה שלהם: -SO 3 H; -COOH; -הו; -PO 3 H 2; -AsO 3 H 2.

הנוסחאות הכימיות של מחליפי קטונים יכולות להיות מיוצגות באופן סכמטי כ-R-SO 3 H; R — SO 3 Na. במקרה הראשון, מחליף הקטיונים הוא בצורת H, בשני, בצורת Na. R היא מטריצה ​​פולימרית.

תגובות חילופי קטונים כתובות כתגובות כימיות הטרוגניות רגילות:

RН + Na + RNA + H +

מחליפי אניונים מכילים קבוצות יונוגניות בסיסיות במבנה שלהם: -N (CH 3) 3 +; = NH 2 +; = NH + וכו'. ניתן לתאר את הנוסחאות הכימיות שלהם כ-RNH 3 OH ו-RNH 3 Cl או ROH, RCl. במקרה הראשון, מחליף האניונים הוא בצורת OH, במקרה השני - בצורת Cl. ניתן לכתוב את תגובת חילופי האניונים באופן הבא:

R – OH + Cl - RCl + OH -

מחליפי יונים אמפוטריים ידועים המכילים קבוצות חומציות ובסיסיות במבנה שלהם. מחליפי יונים המכילים את אותו סוג (לדוגמה, SO 3 H) קבוצות חומצה (בסיסיות) נקראות מונופונקציונליות; מחליפי יונים המכילים סוגים שונים (לדוגמה, SO 3 H, OH) קבוצות חומצה (בסיסיות) רב-פונקציונליות.

מחליפי יונים חד-פונקציונליים מיוצרים על ידי תגובת פילמור. תגובת הקונדנסציה מאפשרת להשיג מחליפי יונים רב-פונקציונליים. על מנת שלמחליפי היונים המתקבלים יהיו מאפיינים תפעוליים גבוהים מספיק, עליהם להיות בלתי מסיסים, אך מתנפחים בממס מתאים ובעלי מספיק מספר גדול שלקבוצות יונוגניות המסוגלות להחליף עם קבוצות יונוגניות של המדגם המנותח. ניתן להשיג זאת אם שרשראות הפולימר המתקבלות מסועפות מספיק ומקושרות זו לזו על ידי "גשרים צולבים". למשל, בייצור מחליפי קטונים מסוג פילמור המבוססים על סטירן, לרוב משתמשים בדיוויניל-בנזן כחומר צולב, שהחדרתו בכמות של עד 16% מבטיחה ייצור של מחליפי יונים בדרגות שונות של נפיחות ו לפיכך, מאפשר לווסת את הנקבוביות של מחליף היונים. דרגת ההתנפחות של מחליף היונים, מבוטאת במיליליטר/גרם, היא נפחו של מחליף יונים יבש באוויר של 1 גרם ארוז בעמודה.

מחליף היונים סופג, ככלל, את אחד מיוני הנגד של היונים בשלב הנייד, כלומר, הוא מפגין סלקטיביות מסוימת. סדרת הזיקה, או הסלקטיביות, של יונים ביחס למחלפי יונים נקבעה בניסוי סוגים שונים... לדוגמה, בריכוזים נמוכים של התמיסה על מחליפי קטונים חומציים מאוד, יונים בעלי מטען זהה נספגים ברצף הבא:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+.

עבור יונים עם מטענים שונים, כושר הספיחה עולה עם הגדלת המטען:

Na + Ca 2+

עם זאת, שינוי בתנאים לביצוע תגובת חילופי היונים יכול להביא להיפוך הסדרה. דרגות זיקה הוקמו גם עבור מחליפי אניונים. לדוגמה, יכולת הספיגה של אניונים על מחליפי אניונים בסיסיים גדלה בסדר הבא:

F -  OH -  Cl -  Br -  NO 3 -  J -  SCN -  ClO 4 -.

מחליפי יונים המכילים קבוצות חומציות חזקות או בסיסיות במבנה שלהם נכנסים לתגובות חילופי יונים עם יונים כלשהם בתמיסה שיש להם מטענים מאותו סימן כמו היון נגדי. מחליפי יונים כאלה נקראים אוניברסליים.

תהליך חילופי היונים בין האנליט למחליף היונים יכול להתבצע באחת משלוש דרכים: סטטי, דינמי (שיטת סינון חילופי יונים) וכרומטוגרפי.

שיטה סטטית חילופי יונים מורכבים מהעובדה שדגימה של מחליף היונים מובאת במגע עם נפח מסוים של התמיסה ומערבבים או מנערים במשך זמן מסוים עד ליצירת שיווי משקל. זוהי שיטה מהירה ופשוטה לחילופי יונים, המשמשת לריכוז יונים מתמיסות מדוללות, להסרת זיהומים מיותרים, אך היא אינה מספקת ספיגה מלאה של יונים, שכן החלפת יונים היא תהליך שאינו בשיווי משקל, ולכן אינו מבטיח מלא הפרדה של יונים.

בעת ביצוע חילופי יונים בצורה דינאמית תמיסה מועברת דרך העמוד עם מחליף היונים, אשר, כאשר היא נעה לאורך העמוד, מגע עם גרגירים חדשים של מחליף היונים. תהליך זה מספק החלפה מלאה יותר מהשיטה הסטטית, שכן תוצרי ההחלפה מוסרים על ידי זרם הפתרונות. הם יכולים לרכז יונים מתמיסות מדוללות ולהפריד יונים בעלי תכונות שונות מאוד, למשל, יונים בעלי מטען שונה (כדי להפריד בין קטיונים לאניונים), אך הפרדת יונים מאותו סימן מטען היא כמעט בלתי אפשרית. ההפרדה הכמותית של יונים כאלה אפשרית רק עם חזרה חוזרת ונשנית על פעולות יסודיות של ספיחה-ספיגה בתנאים דינמיים, כלומר. שיטה כרומטוגרפית ... בעבודה בשיטה זו נעשה שימוש בשכבות גבוהות של מחליף יונים והתערובת המיועדת להפרדה מוכנסת לשכבה זו בכמות קטנה בהרבה מיכולת העמודה, עקב כך מובטחת חזרה מרובה של פעולות חילופי יונים אלמנטריות.

מבחינת טכניקת האנליזה, כרומטוגרפיה של חילופי יונים דומה לכרומטוגרפיה מולקולרית וניתן לבצע אותה על פי וריאנטים של eluent (מתפתח), חזיתי ותזוזה. ההבדל בין כרומטוגרפיה מולקולרית לחילופי יונים הוא שבכרומטוגרפיה מולקולרית מרכיבים המופרדים של התערובת נפלטים מהעמוד עם חומר מוציא טהור, ובחילופי יונים משמשת תמיסת אלקטרוליטים כמפלט. במקרה זה, יש לספוג את היון המוחלף של הבורר באופן פחות סלקטיבי מכל אחד מהיונים בתערובת שיש להפריד.

בעת ביצוע כרומטוגרפיה מתפתחת של חילופי יונים, המשמשת לרוב, העמוד המלא במחליף יונים נשטף תחילה בתמיסת אלקטרוליטים עד שמחליף היונים מחליף לחלוטין את כל היונים שלו ביונים הכלולים במפלט. לאחר מכן מוכנס נפח קטן של תמיסה של האנליט לעמוד, המכיל יונים הניתנים להפרדה בכמות של כ-1% מהקיבולת של מחליף היונים. ואז העמוד נשטף עם תמיסה של eluent, לוקח את השברים של eluate ומנתח אותם.

ניתן להפריד תערובת של יוני Cl -, Br -, J - על מחליף אניונים בסיסי ביותר (פוליסטירן מוצלב המכיל קבוצות של בסיסי אמוניום רבעוניים N (CH 3) 3 +), למשל, AB-17, בעל סדרה של סלקטיביות (סלקטיביות): NO 3 - Cl - Br - J -. כתוצאה מכך, תמיסת NaNO 3 משמשת כמפלט. ראשית, תמיסה זו מועברת דרך מחליף היונים עד שהיא רוויה לחלוטין ביוני NO 3 -. כאשר התערובת המיועדת להפרדה מוכנסת לעמודה, יוני Cl -, Br -, J - נספגים על ידי מחליף האניונים, ומחליפים את יוני NO 3 -. במהלך השטיפה שלאחר מכן של העמוד עם תמיסה של NaNO 3, יוני Cl -, Br -, J - בשכבות העליונות של מחליף האניונים מוחלפים בהדרגה ביוני NO 3 -. יוני Cl - יוזזו הכי מהר, יוני J - יישארו בטור הכי הרבה זמן. ההבדל בסלקטיביות של מחליף היונים ליונים של התערובת מוביל להיווצרות של אזורים נפרדים של יוני Cl -, Br - ו-J - נספגים בעמוד, הנעים לאורך העמוד במהירויות שונות. ככל שאתה עובר בעמודה, המרחק בין האזורים גדל. בכל אזור יש רק אחד מהאניונים של התערובת שיש להפריד והאניון של המדלה, במרווח שבין האזורים יש רק את האניון של הפלטה. לפיכך, שברים המכילים רכיבים בודדים של התערובת המיועדת להפרדה יופיעו במפלט ביציאה מהעמוד.

כדי לפתור בעיות מעשיות, התנאים להפרדת יונים מגוונים על ידי בחירת שלב נייד מתאים (הרכב, ריכוז, pH, חוזק יוני) או על ידי שינוי הנקבוביות של מטריצת הפולימר של מחליף היונים, כלומר, מספר הקשרים בין השרשרת ב המטריצה, ויצירת מסננות חילופי יונים חדירות ליונים מסוימות ומסוגלות להחליף אותם ואטומות לאחרים. אפשר גם לשנות את האופי והסידור ההדדי של קבוצות יונוגניות, כמו גם להשיג סופחים המסוגלים לתגובות כימיות סלקטיביות עקב מורכבות. סלקטיביות גבוהה מוצגת, למשל, על ידי קומפלקס מחליפי יונים המכילים במבנה שלהם קבוצות קלאטיות של ריאגנטים אורגניים dimethylglyoxime, dithizone, 8-hydroxyquinoline וכו', כמו גם אתרים כתר.

השימושים הנפוצים ביותר בכרומטוגרפיה של חילופי יונים, יוניים וזוגי יונים הם מחליפי יונים אורגניים מקרו ומיקרו-רטיקולריים סינתטיים בעלי קיבולת חילופי גבוהה (3-7 ממול/ג'), כמו גם חומרים לחילופי יונים אנאורגניים. מחליפי יונים מיקרו-רשתיים מסוגלים להחליף יונים רק במצב נפוח, מקרו-רטיקולרי - במצב נפוח ולא נפוח. סוג מבני נוסף של מחליפי יונים הם מחליפי יונים בעלי סרט משטח, שהליבה המוצקה שלהם עשויה מקופולימר לא נקבובי של סטירן ודיווינילבנזן, זכוכית או סיליקה ג'ל ומוקפת בסרט דק של מחליף היונים. הקוטר הכולל של חלקיק כזה הוא כ-40 מיקרון, עובי סרט מחליף היונים הוא 1 מיקרון. החיסרון של מחליפי יונים כאלה הוא קוטר החלקיקים הגדול יחסית ויכולת החלפה נמוכה בשל שטח הפנים הספציפי הנמוך, כתוצאה מכך יש לעבוד עם דגימות קטנות ובהתאם להשתמש בגלאים רגישים במיוחד. בנוסף, מחליפי יונים כאלה מורעלים די מהר ואינם מסוגלים להתחדש.

חילופי יונים וכרומטוגרפיית יונים בעלות ביצועים גבוהים משתמשות במחלפי יונים נקבוביים נפחיים, סיליקות נקבוביות נפחיות בקוטר גרגירים של כ-10 מיקרומטר, כמו גם קופולימרים משטחים נקבוביים ומשונים על פני השטח כמעט שאינם מתנפחים של סטירן ודיוויניל-בנזן עם סולפו-יונוגני. וקבוצות אמינו.

בכרומטוגרפיה של זוג יונים משתמשים בחומרי ספיגה של "מברשת" - ג'לי סיליקה עם שלבים הפוכים C 2, C 8, C 18 מושתלים, המומרים בקלות למחליף קטונים עם ספיגה של פעילי שטח יוניים מהפאזה הניידת, למשל, אלקיל. סולפטים או מלחים של בסיסי אמוניום רבעוניים.

בעת ביצוע הפרדה כרומטוגרפית באמצעות מחליפי יונים, תמיסות מימיות של מלחים משמשות לרוב כשלב הנייד. זה נובע מהעובדה שלמים יש תכונות המסה ומייננות מצוינות, שבגללן המולקולות של הדגימה המנותחת מתפרקות באופן מיידי ליונים, קבוצות חילופי היונים של מחליף היונים מתייבשות ועוברות גם לצורה מפורקת באופן מלא או חלקי. . זה מבטיח החלפה מהירה של נגדיונים. חוזק הפליטה של ​​הפאזה הניידת מושפע בעיקר מ-pH, חוזק יוני, אופי תמיסת החוצץ ותכולת הממס האורגני או החומר הפעיל שטחי (כרומטוגרפיה של זוג יונים).

ערך ה-pH נבחר בהתאם לאופי הקבוצות היוניות, היונים המופרדים והמטריצה. אפשר לעבוד עם מחליפי יונים חומציים חזקים ובסיסיים חזקים ב-pH=2-12, עם חומציים חלשים ב-pH=5-12, עם בסיסים חלשים ב-pH=2-6. לא ניתן להשתמש בחומרי ספיגה על בסיס סיליקה ב-pH 9. החוזק היוני של השלב הנייד משפיע על הקיבולת של מחליף היונים. ככל שהחוזק היוני עולה, ספיגת היונים פוחתת בדרך כלל, מכיוון שעוצמת הפליטה של ​​הפאזה הניידת עולה. לכן, בתחילת ההפרדה, הפאזה הניידת צריכה להיות בעלת חוזק יוני נמוך (0.05-0.1), והערך הסופי של מאפיין זה לא יעלה על 2. בגלידת שיפוע, לרוב משתמשים באצ'רים בעלי חוזק יוני עולה.

לאלוציה סלקטיבית של יונים הנספגים במחליף היונים, ניתן להשתמש במים, תמיסות חיץ (פוספט, אצטט, בוראט, הידרוקרבונט וכו') בעלי ערך pH מסוים וחוזק יוני, תמיסות של מינרלים (מלח, חנקן, גופרית, זרחן). ) וחומצות אורגניות (פנול, לימון, לקטית, טרטרית, אוקסלית, EDTA). בחירת חומר ההסרה מקלה על ידי העובדה שמקדמי ההתפלגות המגבילים של רוב היסודות בין תמיסות מימיות (מימיות-אורגניות) של חומרים מורכבים רבים ומחלפי יונים מהסוג הסטנדרטי נקבעים ומוצגים בטבלאות.

1.6.4. כרומטוגרפיה הדרת גודל.כרומטוגרפיה של אי-הגדלה היא סוג של כרומטוגרפיה נוזלים שבה הפרדת הרכיבים מבוססת על חלוקת מולקולות בהתאם לגודלן בין הממס בנקבוביות הסורבנט לבין הממס הזורם בין חלקיקיו. בתהליך ההפרדה חודרות מולקולות קטנות לרשת הפולימר, שבנקבוביותיה הממס משמש כשלב נייח, והן מוחזקים בה. מולקולות גדולות אינן יכולות לחדור לרשת הפולימר והן נשטפות מהעמוד על ידי הפאזה הניידת. תחילה נפלטים המולקולות הגדולות ביותר, לאחר מכן המולקולות הבינוניות ולבסוף המולקולות הקטנות ביותר.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מחולקת לחדירת ג'ל וסינון ג'ל. בכרומטוגרפיה של ג'ל חלחול, הפרדה מתרחשת על פולימרים המתנפחים בממיסים אורגניים. גרסת סינון הג'ל של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כוללת שימוש בפולימרים מתפיחי מים כשלבים נייחים.

משך השמירה של מרכיבי המדגם המנותח בעמודת אי הכללת הגודל תלוי בגודל המולקולות שלהם ובדיפוזיה לנקבוביות הסורבנט, כמו גם בגודל הנקבוביות של השלב הנייח.

בסוג זה של כרומטוגרפיה נוזלית, מקדם ההתפלגות הוא דעבור המולקולות הקטנות ביותר של המדגם המנותח, שנעות בעמודה הכרומטוגרפית במהירות הנמוכה ביותר, חודרות לרשת של השלב הנייח, שווה ל-1, שכן לשלב הנייד ולממס בנקבוביות השלב הנייח יש אותו דבר הרכב. במקרה זה, המשוואה הבסיסית של כרומטוגרפיה עמודה לובשת את הצורה

מולקולות גדולות שאינן חודרות לנקבוביות השלב הנייח נפלטות מהעמוד יחד עם הפאזה הניידת. בשבילם ד= 0, א V ר =V M... טווח זה של ערכי מקדם חלוקה (מ-0 עד 1) אופייני רק לכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל.

יש לשטוף את כל המולקולות של החומר הרב-רכיבי המנותח מהעמודה כאשר מעבירים נפח קטן של ממס מהעמודה V Mלפני V M +V סוההפרדה מסתיימת לפני שיא הממס מופיע. לכן, בסוג זה של כרומטוגרפיה, יש צורך להשתמש בעמודות ארוכות מספיק עם נפח חופשי גדול. V Mומספר רב של נקבוביות בסורבנט.

ניתן לשפר את הרזולוציה של פסגות כרומטוגרפיות בהפרדת הגדלים על ידי שימוש בשחרור גרדיאנט עם ממיסים מעורבים.

כל סורבנט המשמש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מאופיין בנפח נקבוביות מסוים, ולכן יש לו טווח מסוים של משקלים מולקולריים מופרדים ועקומת כיול מסוימת. במקרה זה, לגרף הכיול, המאפיין את התלות של נפח השמירה במשקל המולקולרי או בגודל המולקולות, יש, ככלל, צורה מורכבת.

השלבים הנייחים בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל נבחרים על סמך משימות אנליטיות ספציפיות. בתחילה, נקבע באיזו מערכת ממס ניתן להשתמש לניתוח (מימי או מימי-אורגני). בהתאם לכך, נקבע סוג הסורבנט. אם יש צורך להפריד דגימות מסיסות במים, למשל, דקסטרנים צולבים מתנפחים (Sephadexes) או polyacrylamides (Biogel R) משמשים כשלבים נייחים. ההפרדה של חומרים מסיסים בממסים אורגניים יכולה להתבצע על פוליסטירן בדרגות שונות של הצלבה, התנפחות בממסים אורגניים (קלקר, פורגל, ביובייד C). ג'לים נפוחים כאלה בדרך כלל אינם יציבים ללחץ ומאפשרים קצבי זרימה נמוכים מאוד של השלב הנייד, מה שמגדיל את זמן הניתוח. כדי לבצע גרסה יעילה ביותר של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, יש צורך להשתמש בשלבים נייחים עם מטריצות קשיחות סיליקה ג'לים, החיסרון של פעילות ספיחה גבוהה - מסולק על ידי silanization של פני השטח או בחירה של eluent תואם בקוטביות.

חומרים שיכולים לשמש כשלבים ניידים בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל:

 להמיס לחלוטין את הדגימה המנותחת;

 להרטיב היטב את הסורבנט;

 לנטרל ספיחה של רכיבי הדגימה על הסורבנט;

 בעלי צמיגות ורעילות נמוכה.

1.6.5. כרומטוגרפיה מטוסים... כרומטוגרפיה מישורית כוללת שכבה דקה וכרומטוגרפית נייר. סוגים אלה של כרומטוגרפיה נוזלית הם פשוטים בטכניקה, אקספרס, אינם דורשים ציוד יקר, וזה היתרון הבלתי מעורער שלהם.

ההפרדה של תערובת חומרים בשיטות אלו יכולה להתבצע באמצעות מערכות כרומטוגרפיות שונות. לכן יש ספיחה, הפצה, פאזה נורמלית והפוך, חילופי יונים וכו'. כרומטוגרפיה של נייר ושכבה דקה. כרומטוגרפיה שכבה דקה היא הנפוצה ביותר כיום.

כרומטוגרפיה של נייר וכרומטוגרפיה שכבה דקה דומים בטכניקה. סיבי תאית של נייר משמשים כשלב נייח בכרומטוגרפיית נייר; בכרומטוגרפיה של שכבה דקה מורחים חומרי ספיגה שונים (Al 2 O 3, סיליקה ג'ל וכו') בשכבה דקה אחידה (100 - 300 מיקרומטר) על זכוכית. , מצע מתכת או פלסטיק (נשא) ... שכבת הסופח על המנשא עשויה להיות קבועה או לא.

הפרדה כרומטוגרפית בשיטות במישור, כמו בעמודה, נובעת מהעברת רכיבי אנליט על ידי הפאזה הניידת לאורך שכבת הפאזה הנייחת בקצבים שונים בהתאם למקדמי ההתפלגות של החומרים להפרדה. בשני המקרים נעשה שימוש במערכות כרומטוגרפיות סורבנט נוזל-מוצק (מנגנון הפרדת ספיחה), נשא נוזל-נוזל-מוצק (הפצה, חילופי יונים ומנגנונים נוספים).

ממיסים שונים או תערובות שלהם, חומצות אורגניות או אנאורגניות משמשים כשלבים ניידים.

השגה מעשית של כרומטוגרמות מישוריות היא כדלקמן.

על רצועת נייר כרומטוגרפית או על שכבה דקה של חומר סופח, סמן בעיפרון את קו ההתחלה במרחק של 1 ס"מ מהקצה התחתון של הרצועה או הצלחת. בעזרת מיקרופיפטה, מרחו דגימה על קו ההתחלה בצורה של נקודה בקוטר של לא יותר מ-2 - 3 מ"מ. ואז קצה הרצועה או הצלחת מורידים לתוך כלי עם פאזה ניידת הממוקמת בתא אטום. כאשר הפאזה הניידת עולה לאורך רצועה או צלחת והתרחשות של מספר פעולות יסודיות של ספיחה-ספיגה, חלוקה בין שני שלבים נוזליים, חילופי יונים וכו', הרגילים בכרומטוגרפיה, מרכיבי התערובת המנותחת מופרדים. התהליך נמשך בדרך כלל עד שהממס עובר מקו ההתחלה של 10 ס"מ. לאחר מכן, הרצועה או הצלחת מוסרים מהתא ומייבשים. אם רכיבי אנליט צבעוניים, הם נותנים כתמים צבעוניים תואמים על הכרומטוגרמה. יש לפתח את הכרומטוגרמה כדי לזהות רכיבים לא מוכתמים של האנליט. פיתוח כרומטוגרמה ואיתור רכיבי הדגימה יכולים להתבצע בשיטות שונות ותלוי בהרכב התערובות המנותחות. הביטוי יכול להתבצע:

 שימוש בתאורת UV. השיטה ישימה לזיהוי חומרים המסוגלים לפלוט קרינה משלהם (זוהרת) מטווח אורכי הגל הנראה בהשפעת קרינת UV;

 באמצעות פיתוח ריאגנטים. לדוגמה, ניתן לזהות נוכחות של חומצות אמינו בתערובת המנותחת באמצעות ninhydrin. הכרומטוגרמה המיובשת נטבלת בתמיסת 0.2% של נינהידרין באציטון ולאחר מכן מיובשת. הכתמים התואמים למרכיבים השונים של התערובת מקבלים צבע ויזואלי, וככלל, צבע ספציפי לכל חומר;

 שימוש ביוד. במקרה זה, הכרומטוגרמה שזוהתה מוכנסת לכלי עם גבישי יוד בתחתית. אדי יוד נספגים בצורה חזקה יותר על הכתמים, שבגללם הכתמים מומחשים. יוד הוא מגיב מפתח לא ספציפי. באמצעות ריאגנטים ספציפיים, ניתן לא רק לקבוע את כמות מרכיבי התערובת, אלא גם לזהות את החומרים המופרדים לפי צבע הכתמים.

כרומטוגרפיה של נייר וכרומטוגרפיה בשכבה דקה מבוצעות לרוב בצורה הנקראת מלמטה למעלה שתוארה לעיל. לעתים קרובות למדי, כדי לשפר את איכות הכרומטוגרמות, יש צורך להשתמש בגרסאות מורכבות יותר של כרומטוגרפיה מישורית, למשל, מלמעלה למטה, מעגלית, דו מימדית. בכרומטוגרפיה של נייר מלמעלה למטה או בשכבה דקה, האנליט מוחל על קו ההתחלה של הצלחת או רצועת הנייר מלמעלה, והפלט מוזן מלמעלה ולא מלמטה. ההשפעה החיובית של הפרדה משופרת נובעת מתרומת כוח המשיכה לתהליך ההפרדה.

ניתן לבצע גם כרומטוגרפיה עולה וגם יורדת בגרסאות חד-מימדיות. בניגוד לתהליך ההפרדה החד-ממדית המתואר לעיל בשכבה שטוחה בהפרדה כרומטוגרפית דו-ממדית, הפרדת הדגימה המנותחת מתבצעת תחילה בממס אחד, לאחר מכן מתבצעת ההפרדה בכיוון המאונך לראשון. , באמצעות ממס אחר, על ידי הפיכת הכרומטוגרמה הראשונה ב-90 מעלות צלזיוס.

בכרומטוגרפיה מעגלית, האנליט מוחל כטיפה באמצע צלחת או גיליון נייר כרומטוגרפי. ממס אחד או יותר מסופקים כאן בטיפות. כתוצאה מכך הכרומטוגרמה המתקבלת היא קבוצה של כתמים רדיאליים.

מיקום הכתמים (האזורים) היוצרים את הרכיבים המופרדים של האנליט על כרומטוגרמה שטוחה מאופיין בערכי מהירות התנועה היחסית של הרכיבים בשכבה דקה ר fi... בניסוי, הכמות ר fiמוגדר כיחס בין המרחק ל אניעבר אניהרכיב, למרחק לנסע על ידי הממס מקו הזינוק לקו הקדמי (איור 1.10):

העצמה ר fiתלוי באופי הרכיב התואם של המדגם המנותח, באופי השלב הנייח, בעוביו, באופי ואיכות השלב הנייד, בשיטת יישום הדגימה ובגורמים נוספים, אך תמיד ר fi 1.

העצמה ר fiזהה למעשה לזמן ההחזקה של החומר או לנפח האחזקה שלו, המאפיין את קצב מעבר החומר בעמודה הכרומטוגרפית, וניתן להשתמש בו לזיהוי איכותי של מרכיבי הדגימה המנותחת, וקוטר הנקודה זהה. לגובה או לאזור של השיא הכרומטוגרפי, ולכן משקף במידה מסוימת את התוכן הכמותי של החומר.

במקרה הפשוט ביותר, ניתן להעריך חזותית את הקביעה הכמותית של הרכב המדגם המנותח על ידי עוצמת הצבע הפנימי של הכתמים או עוצמת הזוהר הפלורסנטי של הכתמים המתקבלים במהלך זיהוי UV. למטרות אלו נעשה שימוש נרחב בחליפת נקודה כרומטוגרפית. במקרה זה, הכתם המתקבל על הכרומטוגרמה נחתך בזהירות או מגרד אותו, מטופל בממס מתאים, והתמיסה המתקבלת נבדקת בשיטה הפיזיקוכימית המתאימה. אפשר גם להשתמש בשיטה הגרבימטרית, שבה חותכים את הכתם המתאים מהכרומטוגרמה ושוקלים. כמות החומר נקבעת על פי ההפרש בין משקלי נייר ריק מאותו אזור לנייר עם החומר.

עיתון (BH ) ו שכבה דקה של כרומטוגרפיה (TLC ) על ידי מנגנון ההפרדה מתייחסים כרומטוגרפיית מחיצה ... בשיטת BH המנשא הוא מיוחד נייר כרומטוגרפי עם מאפיינים מסוימים. שלב נייח משמש כמים הנספגים על פני השטח ונקבוביות הנייר (עד 20%), נייד  ממס אורגני, מתערבב או בלתי לערבב עם מים, מים או תמיסות אלקטרוליטים.

מַנגָנוֹן די מסובך על הנייר. בשלב נייח, חומר יכול להישמר לא רק בגלל התמוססות במים הנספגים בנייר, אלא גם לִסְפּוֹג ישירות עם תאית. מודפס על נייר רכיבים משותפים עוברים לשלב הנייד ונימי הנייר נעים במהירויות שונות בהתאם מקדם התפלגות בין-פאזי כל אחד מהם. בהתחלה כרומטוגרפיה חלק מהחומר מהנייר נכנס שלב נייד ותמשיך הלאה. כאשר הממס האורגני מגיע לאזור נטול המומסים של הנייר, הוא מתרחש שוב חלוקה מחדש : מהשלב האורגני, החומר עובר למימי, נספג על נייר. מאז הרכיבים יש שונים זיקה לסופח , כשהפלט זז, מתרחשת הפרדה: חלק מהחומרים מתעכבים בתחילת הדרך, אחרים מתקדמים יותר. כאן משולבים תרמודינמית (קביעת חלוקת שיווי משקל של חומרים בין שלבים) ו קִינֵטִי (תנועה של רכיבים במהירויות שונות) היבטים של הפרדה. כתוצאה מכך, כל רכיב מרוכז באזור מסוים של גיליון הנייר: תחומים של רכיבים בודדים עַל כרומטוגרמה ... לשימוש בכרומטוגרפיה על נייר יש מספר חסרונות משמעותיים: התלות של תהליך ההפרדה בהרכב ובתכונות הנייר, השינוי בתכולת המים בנקבוביות הנייר כאשר תנאי האחסון משתנים, כרומטוגרפיה נמוכה מאוד. קצב (עד מספר ימים), ושחזור נמוך של תוצאות. חסרונות אלו משפיעים ברצינות על התפשטות כרומטוגרפיית נייר כשיטה כרומטוגרפית.

V שיטת TLC תהליך ההפרדה של תערובת חומרים מתבצע בשכבה דקה סופג מוחל על מצע מוצק אינרטי ומסופק על ידי תנועה שלב נייד (ממס) דרך הסורבנט תחת הפעולה כוחות נימיים . על ידימנגנון הפרדה לְהַבחִין כרומטוגרפיה של הפצה, ספיחה וחילופי יונים ... הפרדת רכיבים מתרחשת במקרים אלה או כתוצאה ממקדם החלוקה השונה שלהם בין שני שלבים נוזליים ( כרומטוגרפיית מחיצה ), או בשל יכולת הספיגה השונה של התרכובות על ידי הסורבנט ( כרומטוגרפיה של ספיחה ). שיטת הספיחה מבוססת על דרגות שונות של ספיחה-ספיגה של הרכיבים המופרדים על השלב הנייח. סְפִיחָה מבוצע על חשבון כוחות ואן דר ואלס שהוא הבסיס ספיחה פיזית , פולימולקולרית (היווצרות של מספר שכבות של אדסורבט על פני השטח של הסופח) ו כימיספציה (אינטראקציה כימית של סופח ואדסורבט).

במקרה של שימוש עבור TLC סופגים כגון אלומינה אוֹ סיליקה ג'ל בחטיבה לשחק תפקיד כמו הפצה ו סְפִיחָה על המשטח הפעיל המפותח של הסורבנט (150 - 750 מ"ר / גרם). הפצה מרכיבי התערובת מתרחשים בין מים על פני השטח של המוביל (כגון סופחים , איך אלומינה , עֲמִילָן , תָאִית , אדמה דיאטומית - ו מים טופס שלב נייח ), וממס שעובר דרך השלב הנייח הזה ( שלב נייד ). מרכיב התערובת, המסיס יותר במים, נע לאט יותר מזה שמסיס בקלות רבה יותר בשלב הנייד.

סְפִיחָה מתבטא בכך שבין מוֹבִיל , למשל, תחמוצת אלומיניום, ומרכיבי התערובת מוגדרים שיווי משקל בספיחה - לכל רכיב משלו, התוצאה שלו היא מהירות תנועה שונה מרכיבי תערובת. ניתן להבחין בין שני מקרים קיצוניים:

א) ריכוז החומר על הסופח הוא אפס. החומר מתמוסס לחלוטין בשלב הנייד ונסחף אליו (נע יחד עם חזית ממס ).

ב) החומר נספג לחלוטין, אינו יוצר אינטראקציה עם הממס ונשאר בהתחלה.

בפועל, עם מבחר מיומן של ממס וסופח הפצה קשרים ממוקמים בין מקרי קיצון אלה, לבין החומר בהדרגה נשא מעל משכבת ​​ספיגה אחת לאחרת עקב תהליכים בו-זמניים ספיגה ו ספיגה .

הממס העובר דרך הסורבנט נקרא מחסל , תהליך הזזת החומר יחד עם חומר הפלטה  פליטה . כשהנוזל נע על הצלחת, תערובת החומרים נפרדת עקב פעולת הכוחות סְפִיחָה , הפצה , חילוף יונים או שילוב של הפעולות של כל הגורמים לעיל. כתוצאה מכך, נפרד אזורים כרומטוגרפיים מרכיבי תערובת, כלומר. מתברר כרומטוגרמה .

בחירה נכונה סופג ו מחסל קובע את יעילות ההפרדה של התערובת. הניידות של החומר הנבדק תלויה בזיקה שלו לסופג ו כוח פולט (קוטביות) של eluent. עם עלייה בקוטביות של תרכובת, גם הזיקה שלה לסופג הקוטבי עולה. על ידי הגדלת מידת הספיחה סיליקה ג'ל תרכובות אורגניות מסודרות בשורה: פחמימנים<алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь עבור סיליקה ג'ל ניתן לסדר את eluents בסדר עולה של "קוטביות" ( יכולת פליטה ) ויוצרים סדרה של ממיסים ( סדרה eluotropic ) בהתאם לנתוני הניסוי: אלקנים> בנזן> כלורופורם> דיאתיל אתר> אתיל אצטט> אלכוהולים C 2 -C 4> מים> אצטון> חומצה אצטית> מתנול. לפיכך, התרכובת הקוטבית, אלכוהול, נספגת בצורה חזקה למדי על סיליקה ג'ל ולכן נעה בצורה חלשה תחת פעולתו של ממס לא קוטבי כזה כמו הקסאן ונשארת ליד קו הזינוק. בתורו, הביפניל הפחמימני הארומטי הלא קוטבי הוא נייד יותר באופן ניכר בהקסאן, אבל גם כאן, כדי להשיג ר ו בערך 0.5, נדרש חומר אפרוטי קוטבי יותר, מתילן כלוריד. חוזק משחרר לווסת באמצעות תערובת של ממיסים - שכנים סדרה eluotropic עם קוטביות שונה.

נכון לעכשיו, הדברים הבאים משמשים בעיקר ב-TLC. סופחים : לפצל חומרים ליפופיליים  סיליקה ג'ל , אלומינה , תאית אצטילטית , פוליאמידים ; לשתף חומרים הידרופיליים  תָאִית , מחליפי יונים של תאית , אדמה דיאטומית , פוליאמידים ... המאפיין החשוב ביותר של הסורבנט הוא שלו פעילות , כלומר יְכוֹלֶת sorb (מחזיקים) את מרכיבי התערובת שיש להפריד. בחו"ל מספר חברות מייצרות סיליקה ג'ל , אדמה דיאטומית ו אלומינה עם תוספת של 5% גבס, המשמש לקיבוע שכבת הספיגה בייצור עצמי של צלחות.

הסורבנט הנפוץ ביותר הוא סיליקה ג'ל - חומצה סיליקית hydrated, שנוצרת על ידי פעולת חומצות מינרלים על Na 2 SiO 3 וייבוש הסול שנוצר. לאחר טחינת הסול, נעשה שימוש בחלק מגודל גרגר מסוים (מצוין על הצלחת, בדרך כלל 5-20 מיקרומטר). סיליקה ג'ל הוא סופג קוטבי עם קבוצות ОН כמרכזים פעילים. הוא סופג בקלות מים על פני השטח ויוצר קשרי מימן.

אלומינה הוא סופח בסיסי חלש ומשמש בעיקר להפרדת תרכובות בעלות אופי בסיסי ונייטרלי חלש. החיסרון של צלחות על אלומינה הוא הפעלה חובה של פני השטח לפני השימוש בתנור ייבוש בטמפרטורה גבוהה (100 - 150 מעלות צלזיוס) וביכולת הספיחה של השכבה נמוכה בהשוואה לסיליקה ג'ל.

קיזלגור  סופח המתקבל ממינרלים טבעיים  אדמה דיאטומית. לסורבנט תכונות הידרופיליות ויכולת ספיחה נמוכה יותר של השכבה בהשוואה לסיליקה ג'ל.

תָאִית: לוחות שכבה דקה מצופות תאית יעילות מאוד להפרדה של מולקולות אורגניות מורכבות. הסופח הוא בעיקר כדורי תאית בקוטר של עד 50 מיקרון, המקובעים על מנשא עם עמילן. כמו בכרומטוגרפיית נייר, עליית חזית הממס היא איטית מאוד.

ניתוח כרומטוגרפי מבוצע על צלחות תעשייתיות של ייצור צ'כי" סילופול » (« סילופול ") עשוי מרדיד אלומיניום, לפעמים מחוזק בקרטון, ו" סילופלסט » עשוי מפלסטיק מצופה בשכבת סופגים - סיליקה ג'ל LS 5-40 עם עמילן או גבס כחומר מקשר (עד 10%), או תחמוצת אלומיניום עם וללא מחווני ניאון. צלחות" סילופול »בעלי קצב אלוציה גבוה, אך יחד עם זאת הם מאופיינים ביכולת הפרדה נמוכה ורגישות נמוכה. במהלך האחסון, הם רגישים לתנאים (לחות, טמפרטורה, סביבות אגרסיביות וכו'). חברות בודדות מספקות לוחות כרומטוגרפיים עם שכבת ספיגה שונה (בדרך כלל עד 0.25 מ"מ), אך בעובי קבוע בהחלט (סיליקה ג'ל, תאית, שרף מחליף יונים), על זכוכית ומצעים עשויים רדיד אלומיניום, פלסטיק, סיבי זכוכית ספוג.

צלחות" סורבפיל "(TU 26-11-17-89) מיוצרים ברוסיה על בסיס פולימרי (פוליאתילן טרפתלט, דרגה P) או על מצע אלומיניום (דרגה AF) עם שכבת עבודה מיושם חומר סופג סיליקה ג'ל מפוצל במיקרו דרגות STKH-1A ו-STKH-1VE (מיוצר בברית המועצות כסיליקה ג'ל מפוצלת KSKG) בעובי של 90-120 מיקרון (עד 200 מיקרון), קבוע עם קלסר מיוחד - סיליקסול ... בשימוש כסולל מקשר של חומצה סיליקית (סיליקה סול), אשר לאחר החימום הופכת לסיליקה ג'ל, לוחות ה-TLC המתקבלים מורכבים משני מרכיבים: שכבת סיליקה ג'ל ומצע. אחידות העובי של שכבת הסורב בצלחת אחת היא ± 5 מיקרון. דוגמה לייעוד: "Sorbfil-PTSKh-AF-V-UV (10x10)" - לוחות TLC בעלות ביצועים גבוהים על מצע אלומיניום, עם פוספור, 10x10 ס"מ.

אם נעשה שימוש במצע זכוכית (דרגה C), אז לוחות כאלה ניתנים לשימוש חוזר ועמידות כימית. העמידות הכימית שלהם נקבעת על ידי העמידות הכימית של סיליקה ג'ל. כתוצאה מכך, ניתן לטפל שוב ושוב בלוחות TLC עם ריאגנטים אגרסיביים, למשל, תערובת כרום חמה, אשר מסירה הגבלות על השימוש בריאגנטים מתואמים לזיהוי נקודתי ושינוי ספיגה, ומאפשרת התחדשות מרובה (עד פי 30 או יותר) של צלחות עם תערובת כרום. ניתן לחתוך צלחות זכוכית לגודל הנדרש. ניתן להתאים את החוזק המכני של השכבה הסופגת, המספקת, מצד אחד, את ההובלה והעיבוד החוזר של הלוחות ומצד שני, אפשרות לחילוץ שכבות ספיגה עם חומרים מופרדים לשטיפה לאחר מכן מתוך תרכובות בודדות. הסורבנט ומחקר נוסף שלהם בשיטות אינסטרומנטליות (ספקטרומטריית IR ו-UV, שיטות מבנה של קרני רנטגן, NMR וכו').

הלוחות נבדלים זה מזה בגודל השברים (חלוקת החלקיקים) של סיליקה ג'ל ממנו מורכבת השכבה. על לוחות אנליטיים (דרגה A), השבר הוא 5-17 מיקרון, על ביצועים גבוהים (דרגה B) - 8-12 מיקרון. חלוקה צרה יותר מגבירה את יעילות התוספות, כלומר. הכתמים של החומרים שיש להפריד הופכים לדחוסים יותר (קטנים יותר בגודלם) ולכן מופרדים טוב יותר כאשר החזית הנפלטת עוברת למרחק קצר יותר. על צלחות רוסיות, שכבות אנליטיות וביצועים גבוהות אינן שונות במיוחד, בניגוד לצלחות ממרק (גרמניה). השתמש בצלחות עם ביצועים גבוהים אם חומרים אינם מופרדים על לוחות הבדיקה. לוחות של כל השינויים מיוצרים עם זרחן (דרגת UV) עם עירור של 254 ננומטר. חיי המדף אינם מוגבלים, צלחות" סורבפיל »נבדקים באופן נרחב בניתוח של נגזרות של חומצות אמינו, חומרי הדברה, שומנים, אנטיביוטיקה.

מתבצעת שיטת TLC זיהוי איכותי רכיבים. כימות עבור TLC אפשרי גם, זה דורש יישום של כמות מדויקת של החומר ועוד מחקרים דנסיטומטריים עם קיבוע ברור של עוצמת הכתמים. הנפוץ ביותר הוא שיטה חצי כמותית ... זה מבוסס על השוואה ויזואלית הגודל והעוצמה של כתם של רכיב עם המאפיינים התואמים של סדרה של כתמים של אותו חומר בריכוזים שונים ( פתרונות התייחסות סטנדרטיים ). כאשר משתמשים בדגימה בכמות של 1-5 מיקרוגרם בשיטה כה פשוטה, הדיוק בקביעת תכולת הרכיב הוא כ-5-10%. לעתים קרובות, כדי לקבוע את הרכיבים בדגימה, יש צורך לבצע הכנת דגימה על מנת לקבל תערובת המכילה את התרכובות המנותחות. הכנת הדגימה מבוססת על מיצוי תרופות מהדגימה עם ממיסים אורגניים ( נ-הקסאן, אתר נפט, אתר דיאתיל, כלורופורם), טיהור התמצית וכרומטוגרפיה לאחר מכן בשכבה דקה של אלומינה או סיליקה ג'ל.

ישנן מספר אפשרויות עבור TLC ו-BH, השונות בדרך אספקת ממס ... בהתאם לכיוון התנועה של השלב הנייד, ישנם:

א)כרומטוגרפיה עולה  השלב הנייד מוזג על החלק התחתון של תא ההפרדה, הנייר (צלחת) ממוקם אנכית;

ב)כרומטוגרפיה מלמעלה למטה  השלב הנייד מוזן מלמעלה ונע כלפי מטה לאורך שכבת הספיגה של הצלחת או הנייר;

v)כרומטוגרפיה רדיאלית  התקדמות אופקית של חזית הממס: השלב הנייד מובא למרכז דיסקת הנייר (צלחת), שם מורחים את התערובת שיש להפריד.

הנפוץ ביותר הוא פליטה כלפי מעלה (כרומטוגרפיה). חֲזִית מחסל תוך כדי מעבר מלמטה למעלה. בחירת הממס (פאזה ניידת) נקבעת על פי אופי הסורבנט ותכונות החומרים להפרדה.

הפרדה כרומטוגרפית שיטות BC ו-TLC מתבצעות ב תא הפרדה עם מכסה מכוסה. מדד כמותי של קצב ההעברה של חומר בעת שימוש בסופח וממס מסוים הוא ערך R ו (מהאנגלית. הַחזָקָה גורם האם מקדם ההשהיה, פרמטר זה מקביל לזמן ההחזקה). עמדה אזורים של הרכיב שעבר כרומטוגרפיה מוגדר בגודל מְקַדֵם ר ו , שווה ליחס בין מהירות התנועה של האזור שלו למהירות התנועה של חזית הממס. העצמה ר ו הוא תמיד פחות מאחד ואינו תלוי באורך הכרומטוגרמה. לפי הסכום ר ו גורמים שונים משפיעים. אז, בטמפרטורות נמוכות, חומרים נעים לאט יותר; זיהום של ממסים, חוסר הומוגניות של הסופח, יונים זרים בתמיסה המנותחת יכולים לשנות את הערך ר ו עד 10%. במערכת הנבחרת, לאנליטים צריכים להיות משמעויות שונות. ר ו ומופץ לכל אורך הכרומטוגרמה. רצוי שהערכים ר ו שוכב בטווח של 0.05-0.85.

בפועל, הערך ר ו מחושב כיחס בין המרחק ל החומר עובר למרחקים ל עבר ליד הממס:

ר ו = l / L (6.1 )

בדרך כלל הם בוחרים לחישוב מרכז המקום (איור 1). העצמה ר ו תלוי בגורמים רבים: סוג נייר כרומטוגרפי (הנקבוביות שלו, הצפיפות, העובי, מידת ההידרציה) ו סופג (גודל גרגר, אופי הקבוצות על פני השטח, עובי השכבה, תכולת הלחות, אופי החומר, הרכב הפאזה הניידת), תנאי ניסוי (טמפרטורה, זמן כרומטוגרפיה וכו'). עם הקביעות של כל הפרמטרים הכרומטוגרפיים, הערך ר ו נקבע רק על ידי המאפיינים האישיים של כל רכיב.

אורז. 1. קביעת הערכים על הכרומטוגרמה Rf עבור רכיבים או V,

מידת ההפרדה ביניהם Rs ומספר הלוחות התיאורטיים נ .

היעילות של BC ו-TLC תלויה גם ב סלקטיביות ורגישות תגובות המשמשות לזיהוי מרכיבי התערובת המנותחת. בדרך כלל, משתמשים בריאגנטים היוצרים תרכובות צבעוניות - מפתחים עם הרכיבים שייקבעו. ליותר אמין זיהוי רכיבים משותפים להגיש מועמדות " עדים "פתרונות חומרים סטנדרטיים (באותו ממס כמו המדגם) שצפוי להיות בדגימה. חומר סטנדרטי הוחל על קו הזינוק ליד המדגם המנותח ובוצע כרומטוגרפיה באותם תנאים. בפועל, ערך יחסי משמש לעתים קרובות:

ר ו rel = ר ו איקס / ר ו לַעֲמוֹד (6.2)

איפה ר ו לַעֲמוֹד מחושב גם לפי נוסחה (6.1). יְעִילוּת הפרדה כרומטוגרפית לאפיין מספר לוחות תיאורטיים שוות ערך והם גוֹבַה ... לפיכך, בשיטת TLC, מספר הלוחות התיאורטיים השווים הוא נ אעבור רכיב אהתערובת שיש להפריד מחושבת לפי הנוסחה:

נ א = 16 (ל OA / א (א )) 2 (6.3)

הערכים ל OA ו א (א ) נקבע כפי שמוצג באיור. 6.1. ואז גובה הלוח התיאורטי המקביל נ א הוא:

ח א = ל OA / נ = א (א ) 2 / 16 ל OA . (6.4)

הפרדה אפשרית באופן מעשי אם ר ו (א)  ר ו (V)  0,1 .

לאפיין את ההפרדה בין שני המרכיבים או Vלהשתמש דרגת (קריטריון) של הפרדה Rs :

Rs =  אני / (א (א) / 2 + א (ב) / 2)= 2  אני / (א (א) + א (ב)) (6.5)

איפה  ל  מרחק בין מרכזי הכתמים של הרכיבים או V;

א (א) ו א (V)  קוטרי נקודה או Vעל הכרומטוגרמה (איור 6.1). יותר Rs , ככל שהכתמים של הרכיבים ברורים יותר או Vעל הכרומטוגרמה. תנאים כרומטוגרפיה נבחרים כך שהערך Rs שונה מאפס ואחד, הערך האופטימלי Rs הוא 0.3  0.7. לשיעור סלקטיביות הפרדה שני מרכיבים או Vלהשתמש יחס פיצול α :

α = ל ב / ל א (6.6)

אם α = 1, אז הרכיבים או Vאינם משותפים.

9801 0

HPLC היא כרומטוגרפיה של עמודת נוזלים, בה ניתן להשתמש במגוון מנגנוני ספיגה. בעיקרו של דבר, HPLC היא צורה מודרנית של יישום של כרומטוגרפיה קלאסית של עמודת נוזלים. כמה ממאפייני האיכות המשמעותיים ביותר של HPLC מפורטים להלן:
- מהירות גבוהה של התהליך, שאפשרה להפחית את זמן ההפרדה ממספר שעות וימים לדקות;
- מידת הדיפוזיה המינימלית של אזורים כרומטוגרפיים, המאפשרת להפריד בין תרכובות שנבדלות רק במעט בקבועי הספיחה;
- רמה גבוהה של מיכון ואוטומציה של הפרדת ועיבוד מידע, שבזכותה הגיעה כרומטוגרפיית עמודת נוזלים לרמה חדשה של שחזור ודיוק.

מחקרים אינטנסיביים של העשורים האחרונים, כמות עצומה של נתונים ניסויים מצטברים מאפשרים היום לדבר על סיווג גרסאות במסגרת השיטה של ​​כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. כמובן שבמקרה זה, הסיווג לפי מנגנון הספיגה, שניתן לעיל, נשאר בתוקף.

סיווג נרחב מבוסס על הקוטביות ההשוואתית של השלבים הניידים והנייחים. במקרה זה, מבחינים בין כרומטוגרפיה רגילה לפאזית הפוכה.

כרומטוגרפיה רגילה (NPC) היא גרסה של HPLC כאשר הפאזה הניידת פחות קוטבית מהפאזה הנייחת, ויש סיבה להאמין שהגורם העיקרי הקובע את השמירה הוא האינטראקציה של סורבטים ישירות עם פני השטח או עם נפח ה-. סופג.

כרומטוגרפיה הפוכה (RPC) היא גרסה של HPLC, כאשר הפאזה הניידת קוטבית יותר מהפאזה הנייחת, והשמירה נקבעת על ידי המגע הישיר של מולקולות הסורבט עם פני השטח או נפח הסורבנט; במקרה זה, סורבטים מיוננים אינם מוחלפים ליונים מהפאזה הניידת, הנספגים על פני השטח.

כרומטוגרפיה של חילופי יונים - גרסה שבה הספיחה מתבצעת על ידי החלפת יונים נספחים מהפאזה הניידת ליונים של חומרים שעברו כרומטוגרפיה; באופן אנלוגי לחלוטין, אתה יכול להגדיר כרומטוגרפיה של חילופי ליגנדים.

כרומטוגרפיה על סורבנטים שעברו שינוי דינמי היא גרסה של HPLC שבה הסורבט אינו יוצר אינטראקציה ישירה עם פני השטח של הסורבנט, אלא נכנס לקשר עם המולקולות של שכבות פני השטח של חומר הספיגה.
כרומטוגרפיה של זוג יונים היא גרסה של כרומטוגרפיה הפוכה של תרכובות מיוננות שבהן מתווסף יון נגדי הידרופובי לפאזה הניידת, אשר משנה באופן איכותי את מאפייני הספיחה של המערכת.

כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל היא שיטה להפרדת תרכובות לפי משקלן המולקולרי, המבוססת על ההבדל בקצב הדיפוזיה של מולקולות בגדלים שונים בנקבוביות הפאזה הנייחת.

עבור HPLC, מאפיין חשוב מאוד הוא גודל הסורבנטים, בדרך כלל 3-5 מיקרון, כעת עד 1.8 מיקרון. זה מאפשר הפרדה של תערובות מורכבות של חומרים במהירות ובשלמות (זמן ניתוח ממוצע בין 3 ל-30 דקות).

בעיית ההפרדה נפתרת באמצעות עמודה כרומטוגרפית, שהיא צינורית מלאה בסורבנט. במהלך הניתוח, נוזל (פלט) בהרכב מסוים מוזן דרך עמודה כרומטוגרפית בקצב קבוע. מנה מדודה מדויקת של דגימה מוזרקת לזרם זה. מרכיבי הדגימה המוכנסים לעמוד הכרומטוגרפי, בשל הזיקה השונה שלהם לסופג העמוד, נעים לאורכו במהירויות שונות ומגיעים לגלאי ברצף בנקודות זמן שונות.

לפיכך, העמודה הכרומטוגרפית אחראית על הסלקטיביות ויעילות ההפרדה של הרכיבים. על ידי בחירת סוגים שונים של עמודות, אתה יכול לשלוט במידת ההפרדה של האנליטים. תרכובות מזוהות לפי זמן השמירה שלהן. הקביעה הכמותית של כל אחד מהרכיבים מחושבת על סמך ערך האות האנליטי הנמדד באמצעות גלאי המחובר לשקע העמוד הכרומטוגרפי.

סופחים. היווצרות HPLC קשורה במידה רבה ליצירת דורות חדשים של סופגים בעלי תכונות קינטיות טובות ותכונות תרמודינמיות שונות. החומר העיקרי לסופגים ב-HPLC הוא סיליקה ג'ל. הוא חזק מבחינה מכנית, בעל נקבוביות משמעותית, מה שנותן יכולת החלפה גדולה עם גודל עמוד קטן. גודל החלקיקים הנפוץ ביותר הוא 5-10 מיקרון. ככל שהחלקיקים קרובים יותר לצורה הכדורית, ככל שההתנגדות לזרימה נמוכה יותר, כך היעילות גבוהה יותר, במיוחד אם מסננים חלק צר מאוד (לדוגמה, 7 + 1 מיקרומטר).

שטח הפנים הספציפי של סיליקה ג'ל הוא 10-600 מ' / גרם. ניתן לשנות את סיליקה ג'ל באמצעות קבוצות כימיות שונות המושתלות על פני השטח (C-18, CN, NH2, SO3H), מה שמאפשר להשתמש בחומרים סופחים המבוססים עליו כדי להפריד מגוון רחב של מחלקות של תרכובות. החיסרון העיקרי של סיליקה ג'ל הוא עמידות הכימית הנמוכה שלו ב-pH< 2 и рН >9 (סיליקה מתמוססת באלקליות ובחומצות). לכן, כיום מתקיים חיפוש אינטנסיבי אחר סופגים המבוססים על פולימרים יציבים ב-pH מ-1 עד 14, למשל על בסיס פולימתיל מתאקרילט, פוליסטירן וכו'.

סופחים לכרומטוגרפיה של חילופי יונים. בשל המוזרויות של ההפרדה (במדיום חומצי או אלקליני), החומר הסופג העיקרי הוא פוליסטירן עם דיווינילבנזן בדרגות שונות של הצלבה עם קבוצות SO3 -H + המושתלות על פני השטח שלהן (מחליפי קטונים חומציים מאוד) או -СОО-Naf (מחליפי קטונים חומציים חלשים), -H2N + (CH3) 3Cl- (מחליפי אניונים בסיסיים מאוד) או -N + HR2Cl- (מחליפי אניונים בסיסיים חלשים).

סופחים לכרומטוגרפיה של חדירת ג'ל. הסוג העיקרי הוא סטירן-DVB. כוסות מאקרופוריות, מתיל מתאקרילט, סיליקה ג'ל משמשים גם כן. אותם סופגים משמשים לכרומטוגרפיה של אי הכללת יונים.
משאבות. כדי להבטיח את קצב הזרימה של השלב הנייד (PF) דרך העמודה עם הפרמטרים שצוינו, משתמשים במשאבות בלחץ גבוה. המאפיינים הטכניים החשובים ביותר של משאבות LC הם: טווח זרימה; לחץ עבודה מרבי; שחזור זרימה; טווח הפעימות של אספקת הממס.

לפי אופי אספקת הממס, המשאבות יכולות להיות באספקה ​​קבועה (זרימה) ולחץ קבוע. בעיקרון, עבור עבודה אנליטית, קצב זרימה קבוע משמש, בעת מילוי עמודות - לחץ קבוע. על פי עקרון הפעולה, משאבות מחולקות למשאבות מזרק ומשאבות בוכנה הדדיות.

משאבות מזרק. משאבות מסוג זה מאופיינות בהיעדר כמעט מוחלט של פעימות של זרימת השלב הנייד במהלך הפעולה. חסרונות המשאבה: א) צריכה גבוהה של זמן וממס לשטיפה בעת החלפת הממס; ב) השעיה של הפרדה במהלך מילוי המשאבה; ג) מידות ומשקל גדולים תוך הקפדה על זרימה ולחץ גבוהים (צריך מנוע חזק וכוח בוכנה גדול עם השטח הגדול שלו).

משאבות בוכנה. משאבות מסוג זה מספקות זרימה נפחית קבועה של השלב הנייד למשך זמן רב. לחץ עבודה מקסימלי 300-500 atm, קצב זרימה 0.01-10 מ"ל / דקה. יכולת השחזור של ההזנה הנפחית היא 0.5%. החיסרון העיקרי הוא שהממס מוזן למערכת בצורה של סדרה של דחפים עוקבים, ולכן יש פעימות לחץ וזרימה.

זוהי הסיבה העיקרית לרעש המוגבר ולירידה ברגישות של כמעט כל הגלאים המשמשים ב-LC, במיוחד אלו האלקטרוכימיים. שיטות התמודדות עם פעימות: שימוש במשאבות כפולות או במשאבת Bug-lai כפולה בוכנה, שימוש במכשירי שיכוך ומכשירים אלקטרוניים.

הזרימה הנפחית נקבעת על ידי שלושה פרמטרים: קוטר הבוכנה (בדרך כלל 3.13; 5.0; 7.0 מ"מ), משרעת שלה (12-18 מ"מ) ותדירות (התלויה במהירות הסיבוב של המנוע ותיבת ההילוכים).

מתקנים. מטרת המתקן היא להעביר דגימה בלחץ אטמוספרי לכניסה של עמוד בלחצים של עד מספר אטמוספרות. חשוב שהמתקן לא יכיל נפחים "מתים" שאינם נשטפים על ידי השלב הנייד ודילול הדגימה במהלך ההפקה. בהתחלה, מכשירי LC היו דומים למכשירי גז עם ניקוב ממברנה. עם זאת, הממברנות אינן מחזיקות יותר מ-50-100 אטמוספירות, העמידות הכימית שלהן אינה מספקת, החלקים שלהן מזהמים את מסנני העמודים והנימים.

בשלב הנוזל, קצב הדיפוזיה נמוך בהרבה מאשר בשלב הגז. לכן אפשר למנות תוך הפסקת הזרימה - לדגימה אין זמן להתמוסס במתקן. במהלך הזרקת הדגימה לתוך המתקן, שסתום מיוחד חוסם את זרימת הממס. הלחץ בכניסה לעמוד יורד במהירות; לאחר מספר שניות, ניתן להזריק את הדגימה לתא המתקן באמצעות מזרק מיקרו קונבנציונלי. לאחר מכן, המתקן ננעל, זרימת הממס מופעלת וההפרדה מתבצעת.

הלחץ שסתום זה מחזיק הוא עד 500-800 atm. אבל כאשר הזרימה נעצרת, שיווי המשקל בעמודה מופרע, מה שעלול להוביל להופעת פסגות נוספות "פנויות".

הנפוצים ביותר הם מכשירי לולאה. בעת מילוי המתקן בלחץ גבוה, מופיעים כניסות 1, 2 והתעלה ביניהם. כניסות 3-6, התעלות בינם לבין לולאת המינון בלחץ אטמוספרי המאפשר מילוי הלולאה במזרק או משאבה. כאשר המתקן מסובב, זרימת הפאזה הניידת מעבירה את המדגם לתוך העמודה. כדי להפחית את השגיאה, הלולאה נשטפת עם פי 5-10 מנפח הדגימה. אם הדגימה קטנה, ניתן להזריק אותה לתוך הלולאה עם מזרק מיקרו. נפח הלולאה הוא בדרך כלל 5-50 μL.

עַל. Voinov, T.G. וולובה