לאחר החילוץ של תערובת של חלבונים מחומר ביולוגי, ההפרדה שלה לשברי חלבון בודדים מתבצעת. כמה שיטות של פסירת חלבונים המבוססים על תכונות פיסיקוכימיות שונות של חלבונים פותחו.

– משקעים של חלבונים בנקודה Isoelectric - השיטה מבוססת על רכוש החלבון בנקודה Isoelectric ליפול לתוך משקע בשל הניטרול של המטען של מולקולת חלבון. עבור כל חלבון, הערך של נקודת Isoelectric הוא בהחלט בנפרד, ולכן שיטה זו היא שניתן להקצות חלבונים בודדים (לקבלת מידע נוסף, ראה עבודה מעבדה מס '3 בקורס "ביוכימיה").

– שברים של חלבונים על ידי שתילה - בהתבסס על מסיסות שונה של חלבונים בפתרונות מרוכזים של מלחים נייטרליים, בהתאם למשקל המולקולרי (לקבלת מידע נוסף, ראה עבודה מעבדה מס '3 בקורס "ביוכימיה").

– שיטה של \u200b\u200bהפרדה אלקטרופורטית חלבונים על החלק - מתואר בסעיף מאפיינים פיסיימיים חלבונים.

בנוסף לשיטות לעיל להפרדת חלבונים על שברים שימוש נרחב שיטות chromatographic. . לעתים קרובות בשימוש כרומטוגרפיה עמודה.

תכונה של שיטה זו היא כי תערובת של מולקולות של חלבונים שונים ופפטידים מועבר דרך טור המכיל חומר נקבובי מוצק (מטריקס). כתוצאה של אינטראקציה עם המטריצה, חלבונים שונים עוברים דרך עמודה במהירויות שונות. לאחר החלבונים השיגו ברצף מסוים של החלק התחתון של העמוד, הם נאספים על ידי שברים בודדים בצינור.

שִׂיא שלושה סוגים עיקריים כרומטוגרפיה עמודה:

– חילוף יונים - עבור Chromatography חלבון, מחליפי יון מבוסס על תאית או פולימרים הידרופיליים אחרים משמשים, למשל, DiethylaminoHethyl תאית (dea-cellulose) המכילים קבוצות קטייניות (חיובים שליליים) או המכילים carboxymethylcellulose (cham-cellulose) המכילים קבוצות אמין (חיובי חיובי):

כוח המחייב של חלבונים עם תאית deae גבוה יותר מאשר יותר במולקולה של חלבון של קבוצות carboxyl. חלבונים adsorbed על תאית deae יכול להיות סמוק (eluted) מתוך טור עם פתרונות עם ריכוז הולך וגובר של נתרן כלורי. בתחילה, חלבונים מצמידים חלשים הם eluted, כמו ריכוז מלח גדל ו חלבונים אחרים להגדיל, על מנת להגדיל את זיקה שלהם עבור תאית deae.

בשימוש דומה, אבל זיקה של חלבונים אליו הוא פרופורציונלי ישר למספר קבוצות אמינו במולקולת החלבון.

ה- pH אלואנט גם משתנה כדי להסיר את החלבון המשויך.

– סינון ג'ל כרומטוגרפיה - יש את השם השני "שיטת SIT מולקולרית". כמו sieves להשתמש Sephadex (polysaccharide dextran מטופלים עם הידרין Epichoride). גרגרים Sephadex מתנפחים במים וליצור ג'ל. לבוש גרגירים יש נקבוביות של קוטר מסוים.

ההפרדה מבוססת על העובדה כי דגנים של Sephadex (נקבוביות של הנקבוביות) אינם חדישים או בלתי מוגבלים לחומרים עם משקל מולקולרי גדול, ומולקולות קטנות מפוזרות בחופשיות (חודרות) בשקבוביות של דגנים.

מסה gelling של swatch seadex ממוקם בעמודה זכוכית (צינור), שכבת פתרון חלבון מוחל על משטח ג'ל (איור 12, א) ולאחר מכן פתרון חיץ (נוזל אלוט) מועבר דרך הטור. חלבונים עוברים לאורך הטור בין הגרגירים, האטה יותר, ככל שהמשקל המולקולרי, שכן מולקולות חלבון עם משקל פחות מולקולרי קל יותר לפזר בתוך כדורי (איור 12).

תאנה. 12. שברי חלבונים באמצעות שיטת סינון ג'ל

חלבונים נשטפים (eluted) מן העמודה בסדר יורד של משקל מולקולרי. לכן, מולקולות חלבון גדולות (איור 12, ב) נמצאים לראשונה, שאינם מתפזרים בגרגרים, אז מולקולות קטנות וזימות אחרון מולקולרית נמוכה.

שיטה זו משמשת לא רק עבור פסיקה של חלבונים במשקל המולקולרי, אלא גם לניקוי אותם זיהומים במשקל מולקולרי נמוך.

– כרומטוגרפיה - או כרומטוגרפיה על זיקה. עקרון השיטה טמון בכך שהאינטראקציה הבחירות של חלבונים עם חומרים ספציפיים - ליגנדס קבוע על התקשורת (איור 13).

כמוביל, נפרד מופעל על ידי Bromcian. הפרדה להצטרף ליגנדס ממוצא שונים - מצע, או אנטיגן, או קולטן שתקשה רק חלבון אחד מהתערובת:

- מצע → אנזים;

- אנטיגן → נוגדנים;

- הורמון → קולטן של הורמון זה.

חלבונים אחרים שאינם מחוברים ליגנד מוסרים על ידי שטיפת העמודה.

תאנה. 13. מנגנון של כרומטוגרפיה

הסרת הטור של חלבון בעליית הגג מתבצעת באמצעות פתרון חיץ (אלואנט). המאגר הוא הציג חומר ניקוי כי מחליש את הקשר בין חלבון ליגנד, או פתרון עם ריכוז גבוה של ליגנד חינם הוא עבר את הטור. במקרה זה, החלבון קל יותר לתקשר עם ליגנד חינם והוא נשטף (eluted) מן העמודה.

ניתוח והפרדת פפטידים (חלבונים) 1.
הפרדת ההפרדה - הקצאת אחת או יותר
מרכיבי התערובת במצב הפרט
2.
הפרדה אנליטית - זיהוי וכמות
קביעת רכיבים בתערובת (כולל כימיקלים
טוהר סטריאוכימי)
הפרדה אנליטית עשויה להקדים מראש
על מנת לבחור את שיטת ההפרדה ולקבוע אופטימלי שלה
תנאים.

שיטות החטיבה

מה הם חלבונים (פפטידים) שונים זה מזה?

תוכנית של כרומטוגרפיה עמודה

חילופי יון כרומטוגרפיה

יון חילופי כרומטוגרפיה על תאית ס"מ

כרומטוגרפיה הידרופובי

הכרומטוגרפיה האתניום

כרומטוגרפיה באתניום עם חלבון תגובתי

כרומטוגרפיה ג'ל (סינון ג'ל)

אלקטרונופורזה

2-D אלקטרופורזה

כרומטוגרפיה chemospecific.

כותרת

הבחירה והנקיון של חלבונים מתבצעת בשלבים.

1. הומוגניזציה - זה שחיקה יסודית של אובייקטים מחקר ביוכימי עד הומוגנית, כלומר, מדינה הומוגנית, כלומר, חלבונים כפופים להתפוררות זהירה עד להרס של קיר התא.
במקביל להשתמש:
אבל) סכין homogenizers כגון warring;
ב) Pestika homogenizers פוטר - אלבגים;
ב) כדור ולגלגל מילס - עבור אובייקטים צפופים יותר;
ד) השיטה של \u200b\u200bהקפאה חלופית והפשרה, בעוד tipping של קיר התא מתרחשת תחת פעולה של קרח קריסטל;
ה) את שיטת "פצצה חנקנית" - תחת לחץ גבוה תאים רוויים חנקן, ואז הלחץ הוא משוחרר בחדות, גז חנקן גז משוחרר, אשר, כאילו הוא מכה את התא מבפנים;
ה) UZ, שיטות שונות, עיכול של אנזימים קיר תא. ברוב המקרים, הוא מודגש homogenization, עם חלבונים רבים ניתן לבטל, ולכן כל ההליכים מתבצעים בחדרים קרים ב T 0 או מקורר חומרי גלם עם קרח. במקביל לשלוט בזהירות את נפח הזמן של הרס התא, לחץ עבודה. אידיאלי נחשב כזה homogenizat כי עשוי להיות נתון החילוץ נוסף.

2. מיצוי של חלבונים, כלומר, התרגום שלהם למצב מומס; לרוב, החילוץ מתבצע עם שחיקה באותו זמן.

החילוץ מתבצע:
אבל) פירוק של 8-10% פתרונות מלחים;
ב) באמצעות פתרונות חיץ עם pH מ חומצי alkaline נמוך (beratal, פוספט, ציטראט, טריס - חיץ: תערובת של trisaminetan עם NH2 - CH3 + HCL;
ב) משקעים של חלבונים על ידי ממיסים אורגניים (אתנול, מתנול, בוטנול, אצטון ושילובים שלהם), בעוד פיצול של חלבון שומנים וחלבון חלבון מתרחשת, כלומר, חורבן CHB.

3. ניקוי וחסרונות של חלבונים. לאחר החילוץ, הוא מופרד או פשתן של תערובת חלבונים בודדים וניקוי נוסף:

א) לרסן - זהו תהליך של משקעים של חלבונים עם פתרונות מלוחים נייטרליים של אלקליים ומתכות כדור הארץ אלקליין.

מנגנון המושב - הוסיף פנייה ו קטיונים להרוס את פגז חלבון חלבון של חלבונים, שהוא אחד הגורמים של יציבות של פתרונות חלבון. לרוב להחיל פתרונות של סולפיטים na ואמוניום. חלבונים רבים שונים בגודל של פגז הידר ואת גודל החיוב. עבור כל חלבון יש אזור שתילה משלה. לאחר הסרת סוכן עוזב, החלבון שומר על הפעילות הביולוגית שלו ואת הפיסיקו כימיים נכסים. ב תרגול קליני שיטת השתילה להפרדת Globulins מוחלת (עם תוספת של פתרון של 50% אמוניום Sulfate (NH 4) 2SO 4, המשקף נופל) ואלכומין (עם תוספת של 100% אמוניום פתרון סולפט (NH 4) 2SO 4 טיפות) .

כמות המטעים מושפעת:
1) ריכוז טבע ומלח;
2) סביבות pH;
3) טמפרטורה.

התפקיד הראשי הוא שיחק על ידי ערכו של יונים. לכן, הפעולה של מלח מוערכת על ידי כוח יון של פתרון μ:

, כלומר, הכוח היוני של הפתרון (μ) שווה למוצר ½ ריכוז של כל יון (ג) לכל ריבוע של ערכו (V).

CONMA שיטה היא מגוון של השתילה. במקביל, מיצוי ומשקעים של רכיבים מתרחשת. שינוי הטמפרטורה (בדרך כלל נמוך T O --0 + 8 O), pH של הפתרון ואת אתנול מרוכז, מ פלזמה של דם, עד 18 שברים חלבונים הם מבודדים ברצף.

שיטת קונה המשמשים לייצור תרופות בעת קבלת תחליפי דם;
ב) שיטות כרומטוגרפיה. מייסד הפיתוח של שיטות ניתוח כרומטוגרפי נחשב מדען רוסי Mikhail צבע (1903). נכון לעכשיו, יש הרבה סוגים שלה. השיטה מבוססת על יכולתם של חומרים שיתרפסו באופן ספציפי על ADSOrbent סיכם בעמודה או להציב על כל ספק. במקביל, ההפרדה של החומרים הניתנים ואת הריכוז שלהם בשכבת adsorbent מוגדרת קפדנית מתרחשת. אז המניפים המתאימים (ממיסים) עוברים דרך הטור, אשר מחלשים את כוח ספיחה ומתדרדר חומרים adsorbed מן העמודה. חומרים נאספים באספן של שברים.

היסוד בכרומטוגרפיה מקדם הפצהאשר שווה לגישה של ריכוז החומר ב שלב נעים לריכוז החומר שלב קבוע (אוֹ שלב נייחים).

שלב נייחים - זה יכול להיות מוצק או נוזלי או תערובת של מוצק ונוזלי.

שלב נייד - נוזלי או גזי, הוא זורם בניטרים, או עבר את זה.

בהתאם לסוג של שלב נייחים ניידים ישנם שינויים שונים של ניתוח כרומטוגרפי.

סְפִיחָה - מבוסס על דרגות שונות ספיחה של חלבונים על ידי adsorbent ו מסיסות של אותם ממס המתאים.

AL 2, חומצה סיליקון, אל 2 O 3, CACO 3, MGO, פחם. את adsorbent בצורה של השעיה עם ממס (לעתים קרובות יותר עם פתרון חיץ) הוא ארוז בעמודה (צינור אנכי זכוכית). המדגם מוחל על העמודה, ולאחר מכן ממס או תערובת של ממיסים עובר דרכו.

ההפרדה מבוססת על העובדה כי חומרים גבוהים יותר לכלא. (ב), התקדמות בטור עם מהירות גדולה יותר. אוסף השברים מתבצע באמצעות אספן של שברים.

כרומטוגרפיה ההפצה - בהתבסס על התפלגות תערובת החלבונים בין שני השלבים הנוזלים. ההפרדה יכולה להתרחש על נייר כרומטוגרפי מיוחד, כמו גם בעמודות, כמו בספיטה. השלב מוצק במקרה זה משמש רק תמיכה בשלב נייח נוזלי. נייר כרומטוגרפי יש נכס לעיכוב מים בין סיבי תאית שלה. מים אלה הם שלב נייח קבוע. כאשר, לפי הנייר בפעולה של כוחות נימי, ממס ממס (שלב נעים לא מימי), מולקולות של חומר החלים על הנייר מופצים בין שני השלבים בהתאם למקדם ההפצה שלהם. ככל שהסיסות של החומר בשלב מטלטלין, ככל שהיא תעבור דרך נייר יחד עם הממס.
במקרה של התפלגות של כרומטוגרפיה על טור - ספקים תאית, עמילן, סיליקה ג'ל, וכו ', שלב קבוע - מים. כאשר מוחל על העמודה של החומר, התערובת נע לאורך העמודה עם מהירות שונה לוקח בחשבון Kraspr.

Rf עבור כל חיבור ב תנאי תקן את גודל קבוע.
יון חילופי כרומטוגרפיה - מבוסס על אטרקציה של חלקיקים טעונים מנוגדים. לשם כך, שרפים יונים שונים משמשים: CATE Exchange - מכילים קבוצות טעונה שלילית - סטירנרים סופריים ו- CMS, אשר מושכים יונים טעונים חיוביים של החומרים הנדונים. הם נקראים גם מחליפי יון חומצה.
שרפים חילופי אניה, או מחליפי יון בסיסיים, מכילים קבוצות טעונה חיובית, למשוך מולקולות חלבון טעונה שלילית
Trimethylaminostarol, זהו נגזרת של סטירנרים תאית.
בהתאם q חלבונים מופרדים, מחליפי יון מתאים משמשים, שבו חלבונים מסוימים אינטראקציה, בעוד שאחרים משקיפים בקלות את העמודה. "זירז" על עמוד החלבון מוסר באמצעות פתרונות מלוחים מרוכזים יותר או שינוי pH אלואנט.
כרומטוגרפיה זיקה (או כרומטוגרפיה על זיקה) מבוססת על העיקרון של אינטראקציה אלקטורלית של חלבונים או מקרומולקולות אחרות עם חומרים ספציפיים משותקים - ליגנדס (זה עשוי להיות קואנזים אם האנזים נבדל, נוגדנות אנטיגן ואחרים. בשל הספציפיות הגבוהה של חלבונים ליגנדיות משותקות, הוא הצטרף. רק חלבון אחד של התערובת. הוא נשטף עם תערובות חיץ עם PH שונה או כוח יוני שונה.
כבוד - האפשרות של צעד אחד להקצות חומר נתון עם רמה גבוהה של טוהר.
שיטת ג'ל - סינון או שיטה של \u200b\u200bמולקולרית "לשבת" היא סוג של כרומטוגרפיה חודרת.
ההפרדה של מולקולות בגודל ובצורה מבוססת על המאפיינים של מסננת מולקולרית, שיש להם חומרים נקבובי רבים, למשל, פולימרים אורגניים עם מבנה רשת תלת מימדי שנותן להם את המאפיינים של ג'לים. סינון ג'ל הוא הפרדת חומרים המשתמשים בגלים המבוססים על הבדלים בגודל של מולקולות (seferososis, sephadex, ניתוק, biogeli, וכו '). תחת הפעולה של epichlorohydrin שרשראות polysaccharide של דקסטרן (מסונתז על ידי מיקרואורגניזמים) הם תפור לתוך מבנה רשת, להיות מסיס במים, אבל הם שומרים זיקה גדולה. בזכות הידרופיליות זו, הדגנים שהושגו (הנקראים Sephadex) נפיחות מאוד עם היווצרות של ג'ל שממלא את העמודה. השיטה מבוססת על העובדה שמולקולות גדולות לא חודרות לתוך השלב המינוקי הפנימי, ומולקולות קטנות יותר חודרות לתוך הנקבוביות של הסיטה, כאילו תקוע בהם, ולכן נעים בקצב נמוך יותר. לפיכך, חלבונים עם מר גדול יותר לבוא הראשון למקלט. לאחרונה, בחודר כרומטוגרפיה, גרגרי זכוכית נקבובי משמשים יותר ויותר מסננת מולקולרית.
השיטה האלקטרונית בביוכימיה מבוססת על ההבדל במהירות של תנועה של מולקולות בתחום החשמל (חומצות אמינו, פפטידים, חלבונים, חומצות גרעין).
ההבדל מהירות תנועה תלוי:
1. מ Q מולקולה: Mollekules ניידות, גדול יותר, גדול יותר סך הכל. • הערך תלוי ב- PH;
2. מגודל המולקולות: ככל שהמולקולה גדולה יותר, פחות ניידות. זאת בשל הגידול בכוחות החיכורים ואינטראקציות אלקטרוסטטיות של מולקולות גדולות עם סְבִיבָתִי;
3. מתוך עובש של מולקולות: מולקולות אותו גודל, אבל צורות שונותלדוגמה, סיבנים וחלבון גלובוס יש מהירויות שונות. זאת בשל הבדלים בכוחות החיכוך ואינטראקציה אלקטרוסטטית.
סוגי אלקטרופורזה
א) התמקדות Isoelectric. ההפרדה מתרחשת בעמודה אנכית במעלות. הן ph והן מתח. בעזרת ספקים אמפוליט מיוחדים בעמודה יש \u200b\u200bברד. PH מ 0 עד 14. העמודה ממוקמת תערובת של חומרים, חיבור חשמל. כל אחד מהרכיבים עוברים לחלק זה של הטור, שבו ערך ה- pH מתאים לנקודה האיזואלקטרית שלה ועוצר שם, כלומר, מתמקד.
כבוד: הפרדה, ניקוי וזיהוי של חלבונים בקבלת פנים אחת מתרחשת. השיטה היא היתרים גבוהים (0.02 pi).
ב) IROW Phophoresis הוא אלקטרופורזה על סביבות תמיכה. לאחר הפעלת האלקטרו, את יונים עם הניידות הגבוהה ביותר לעבור האלקטרודה המתאימה הראשון, עם הנמוך ביותר - האחרון עם ניידות ביניים - ממוקמים באמצע.
ג) דיסק אלקטרופורזה - המכשיר מורכב משני כלי עם חיץ - העליון והתחתון, המחובר על ידי צינורות אנכיים המכילים ג'ל נדיף. כמו החלקיקים המיונים מועברים תחת פעולה של זרימה חשמלית. נקבוביות גבוהה יותר - בחלק העליון של הג'ל.
ד) immunoelectrophoresis - שיטה המשלבת אלקטרופורזה עם immunodiffusion (לאיתור אנטיגנים בתערובות פיזיולוגיות מורכבות). תערובת של אנטיגנים ותערובת נוגדנים ממוקמת על נושא מיוחד בניצב זה לזה. כאשר הכוח מופעל, הם מחולקים חומרים בודדים ומפזרים על המוביל ג'ל. במקום המפגש של האנטיגן עם הנוגדן המתאים, מתרחשת תגובה ספציפית של משקעים בצורה של arc. כמויות של ARC וכתוצאה מכך תואמות את מספר האנטיגנים.

שיטות שיטות מר

במספר גדול של חלבונים, ההרכב הכימי ואת רצף של חומצות אמינו לא הוקמו (1010-1012 חלבונים), כך חלבונים אלה קובעים את מר זה משתמש בשיטות שונות.
א) שיטת המשקע - הגדרת מר מתבצעת בצנטריפוגות מיוחדות (הצנטריפוגה הראשונה הוצעה על ידי שוודברג ביוכימאי שוודיה), שבו ההאצה הצנטריפוגלית אפשרית, שהיא יותר מ -200 אלף יותר מאשר מאיצה את האטרקציה הארצית. מר נקבע על ידי V משקעים של מולקולות. כמו מולקולות לעבור מהמרכז לפריפריה, גבול חד של חלבון ממס נוצר. שיעור השקע מתבטא באמצעות קונסטנט שקיעה:

שם V הוא המהירות של הזזת הגבול של ממס חלבון (ס"מ / ים);
 - מהירות רוטור זוויתית (rad / s);
 - המרחק ממרכז הרוטור עד אמצע התא עם פתרון של חלבונים (ס"מ).
גודל הקונסטנט של שקיעה, אשר שווה ל 1,10-13 עם מותנה אימצה עבור 1 והוא נקרא 1 שוודברג (ים). S עבור חלבונים שקרים בתוך 1-50 s, לפעמים עד 100 ש.
מר חלבונים נקבעים על ידי משוואת שוודברג:

שם r הוא קבוע גז אוניברסלי;
T - טמפרטורה מוחלטת בקלווין;
S הוא קבוע שקיעה;
D - מקדם דיפוזיה;
 - צפיפות הממס;
V הוא נפח מסוים חלקי של גז.
שיטה זו היא יקרה בשל השימוש בציוד.
פשוט וזול:
ב) סינון ג'ל בשכבה עדינה של Sephadex.
אורך קילומטראז 'חלבון (במ"מ) הוא בתלות לוגריתמית במר
X - MR של החלבון הרצוי על לוח הזמנים כיול.
ג) דיסק אלקטרופורזה בשכבת polyacrylamide - יש גם תלות בין הלוגריתם של חלבונים של מר כיול לבין אורכו של קילומטראז שלהם.

שיטות לקביעת הומוגניות של חלבונים

מידת הטוהר של החלבון הנבחר נקבעת:

• ultracentrifugation;
• שיטה דיסק - אלקטרופורזה;
• שיטות אימונוכימיות שונות;
• קביעת המסיסות של החלבון (שיטת נורת'Rop) מבוססת על כלל השלב, לפיה המסיסות של החומר הטהור בתנאים אלה של ניסיון תלויה רק \u200b\u200bבטמפרטורה, אך אינה תלויה בריכוז החומר בשלב מוצק .

אם החלבון הוא הומוגני, אז הגרף הופך את הטיה אחת (א), אם יש זיהומים של חלבונים (B, C), אז אנחנו מקבלים כמה קטעים של עקומת הרוויה. לכל החלבונים יש עקומות מסיסות משלהם.

לאחר החילוץ של תערובת של חלבונים מחומר ביולוגי, ההפרדה שלה לשברי חלבון בודדים מתבצעת. כמה שיטות של פסירת חלבונים המבוססים על תכונות פיסיקוכימיות שונות של חלבונים פותחו.

– משקעים של חלבונים בנקודה Isoelectric - השיטה מבוססת על רכוש החלבון בנקודה Isoelectric ליפול לתוך משקע בשל הניטרול של המטען של מולקולת חלבון. עבור כל חלבון, הערך של נקודת Isoelectric הוא בהחלט בנפרד, ולכן שיטה זו היא שניתן להקצות חלבונים בודדים (לקבלת מידע נוסף, ראה עבודה מעבדה מס '3 בקורס "ביוכימיה").

– שברים של חלבונים על ידי שתילה - בהתבסס על מסיסות שונה של חלבונים בפתרונות מרוכזים של מלחים נייטרליים, בהתאם למשקל המולקולרי (לקבלת מידע נוסף, ראה עבודה מעבדה מס '3 בקורס "ביוכימיה").

– שיטה של \u200b\u200bהפרדה אלקטרופורטית חלבונים על חלק - המתואר בסעיף פיסיקו כימיים תכונות של חלבונים.

בנוסף לשיטות לעיל להפרדת חלבונים על שברים שימוש נרחב שיטות chromatographic. . לעתים קרובות בשימוש כרומטוגרפיה עמודה.

תכונה של שיטה זו היא כי תערובת של מולקולות של חלבונים שונים ופפטידים מועבר דרך טור המכיל חומר נקבובי מוצק (מטריקס). כתוצאה של אינטראקציה עם המטריצה, חלבונים שונים עוברים דרך עמודה במהירויות שונות. לאחר החלבונים השיגו ברצף מסוים של החלק התחתון של העמוד, הם נאספים על ידי שברים בודדים בצינור.

שִׂיא שלושה סוגים עיקריים כרומטוגרפיה עמודה:

– חילוף יונים - עבור Chromatography חלבון, מחליפי יון מבוסס על תאית או פולימרים הידרופיליים אחרים משמשים, למשל, DiethylaminoHethyl תאית (dea-cellulose) המכילים קבוצות קטייניות (חיובים שליליים) או המכילים carboxymethylcellulose (cham-cellulose) המכילים קבוצות אמין (חיובי חיובי):

כוח המחייב של חלבונים עם תאית deae גבוה יותר מאשר יותר במולקולה של חלבון של קבוצות carboxyl. חלבונים adsorbed על תאית deae יכול להיות סמוק (eluted) מתוך טור עם פתרונות עם ריכוז הולך וגובר של נתרן כלורי. בתחילה, חלבונים מצמידים חלשים הם eluted, כמו ריכוז מלח גדל ו חלבונים אחרים להגדיל, על מנת להגדיל את זיקה שלהם עבור תאית deae.

בשימוש דומה, אבל זיקה של חלבונים אליו הוא פרופורציונלי ישר למספר קבוצות אמינו במולקולת החלבון.

ה- pH אלואנט גם משתנה כדי להסיר את החלבון המשויך.

– סינון ג'ל כרומטוגרפיה - יש את השם השני "שיטת SIT מולקולרית". כמו sieves להשתמש Sephadex (polysaccharide dextran מטופלים עם הידרין Epichoride). גרגרים Sephadex מתנפחים במים וליצור ג'ל. לבוש גרגירים יש נקבוביות של קוטר מסוים.

ההפרדה מבוססת על העובדה כי דגנים של Sephadex (נקבוביות של הנקבוביות) אינם חדישים או בלתי מוגבלים לחומרים עם משקל מולקולרי גדול, ומולקולות קטנות מפוזרות בחופשיות (חודרות) בשקבוביות של דגנים.

מסה gelling של swatch seadex ממוקם בעמודה זכוכית (צינור), שכבת פתרון חלבון מוחל על משטח ג'ל (איור 12, א) ולאחר מכן פתרון חיץ (נוזל אלוט) מועבר דרך הטור. חלבונים עוברים לאורך הטור בין הגרגירים, האטה יותר, ככל שהמשקל המולקולרי, שכן מולקולות חלבון עם משקל פחות מולקולרי קל יותר לפזר בתוך כדורי (איור 12).

תאנה. 12. שברי חלבונים באמצעות שיטת סינון ג'ל

חלבונים נשטפים (eluted) מן העמודה בסדר יורד של משקל מולקולרי. לכן, מולקולות חלבון גדולות (איור 12, ב) נמצאים לראשונה, שאינם מתפזרים בגרגרים, אז מולקולות קטנות וזימות אחרון מולקולרית נמוכה.

שיטה זו משמשת לא רק עבור פסיקה של חלבונים במשקל המולקולרי, אלא גם לניקוי אותם זיהומים במשקל מולקולרי נמוך.

– כרומטוגרפיה - או כרומטוגרפיה על זיקה. עקרון השיטה טמון בכך שהאינטראקציה הבחירות של חלבונים עם חומרים ספציפיים - ליגנדס קבוע על התקשורת (איור 13).

כמוביל, נפרד מופעל על ידי Bromcian. הפרדה להצטרף ליגנדס ממוצא שונים - מצע, או אנטיגן, או קולטן שתקשה רק חלבון אחד מהתערובת:

- מצע → אנזים;

- אנטיגן → נוגדנים;

- הורמון → קולטן של הורמון זה.

חלבונים אחרים שאינם מחוברים ליגנד מוסרים על ידי שטיפת העמודה.

תאנה. 13. מנגנון של כרומטוגרפיה

הסרת הטור של חלבון בעליית הגג מתבצעת באמצעות פתרון חיץ (אלואנט). המאגר הוא הציג חומר ניקוי כי מחליש את הקשר בין חלבון ליגנד, או פתרון עם ריכוז גבוה של ליגנד חינם הוא עבר את הטור. במקרה זה, החלבון קל יותר לתקשר עם ליגנד חינם והוא נשטף (eluted) מן העמודה.

מה physico- כימיים מוזרויות של חלבונים יכול דרכי ההפרדה יכול להיות מבוסס? ראשית, זה גודל המולקולה, הגיאומטריה שלה. על שימוש בתכונה זו, שיטות של כרומטוגרפיה ג'ל ו ultrafiltration מבוססים, אלקטרופורזה חלקית ג 'ל.

שנית, אופיין של חלוקת חלבון זה של קבוצות טעונה על פני השטח שלה . היחס בין קבוצות קטיוניות ויאניסיות בחלבון משתנה בהתאם לדוק, את נקודות החלבונים האיזואלקטריות - PI (ערכי PH, שבה חיובי חלבון חיובי ושלילי פיצויים לחלוטין, והאשמה הכוללת היא אפס) שונה משמעותית מחלבונים שונים. חלבונים ידועים, שהם קטיי, אניוניק או מולקולות בתנאים פיזיולוגיים ללא דומיננטיות ניכרת של תשלום מסוים. ההבדל בין המטען של חלבונים ב pH שונים מבוסס על ההפרדה שלהם על ידי שיטות אלקטרופורזה, התמקדות Isoelectric, ISOELECTRIC ו- ION Charmatography. למעשה, עם זאת, לא רק את היחס של קבוצות טעונה המגדירה את הערך של PI. חלבונים עם נקודות איסופלסטריות דומות עשוי להיות שונה בהפצת קבוצות פונקציונליות טעונה על פני השטח של הגלובוס. אלה הם ממוקמים יותר או יותר אחיד גם; להיפך, טופס מקומי מתעבה, הגבולות של אותו קבוצות טעונה, המשפיעים על כרומטוגרפיה יון של חלבון.

שלישית, חלבונים שונים במספר ואופי של חלקים משטח הידרופובי, מה משמש כרומטוגרפיה הידרופובי

שים לב שאף אחד מהסימנים לעיל לא יכול להבטיח את שחרורו של חלבון יחיד מתערובת מורכבת - הם אינם אופייניים מספיק, הם אינם מבטיחים את מבחר הניקוי. הרבה יותר מבטיח בעניין זה

השתמש כדי להדגיש את המאפיינים הפונקציונליים של החלבון. ואכן, בין קבוצות של חלבונים בחומר המקור יש רבים כאלה, אשר יש משקל מולקולרי דומה או נקודות איסופליות סגור, עם זאת, את המספר, למשל, phosphatases או Amilas יהיה ברור קטן. ברור, שיטת הבידוד המבוססת על השימוש ביכולתם של אנזימים אלה כדי לקיים אינטראקציה עם המצע הספציפי שלה הוא סלקטיבי באופן לא יעיל מכל קבלת פנים המבוססת על ההבדל של תכונות פיסיקוכימיות.

תוכניות הבחירה של חלבונים באמצעות רק עיקרון אחד, נדיר, בדרך כלל גישות שונות כדי להשתלב ומשלימים אחד את השני.

הפרדת חלבונים במשקל מולקולרי. כרומטוגרפיה ג'ל (סינון ג'ל)

בשיטה זו, להשתמש ג 'ל גרגירים חומרים הידרופילי בצורת צולבות, לדוגמה, dextran (sefhadex, seferosis ואת האנלוגים שלהם), polyacrylamide (ביוגלס אנלוגים שלהם), אלכוהול פוליוויניל (toyochurl). הגרגירים נוצרים על ידי רשת פולימר תלת מימדי, אשר בלתי חדיר עבור מולקולות גדולות, חדיר חלקית עבור מולקולות בגודל ביניים והוא חדיר למולקולות קטנות, מלחים ומים. בהתאם לגודל הממוצע של התא של ג'ל פולימר וגיאומטריה של המולקולה של האחרון, חלק גדול או קטן יותר של ג 'ל גרנולוס סך הכל זמין.

כאשר הפתרון המכיל חלבונים ומולקולות אחרות מועברים, על העמודה, המתמלא גרגירים ג'ל נפוחים, מרכיבי התערובת החודרים לג'ל מתעכבים בו. לכן, הם מפגרים מאחורי מולקולות גדולות יותר, כי לא ניתן להיכנס כדורים פנימה והם רק בפתרון הכביסה. לא נכלל בג'ל, מולקולות גדולות מופיעות באלואנט, ברגע שהפתרון "החופשי" עובר דרך העמודה, השווה לפתרון שהסתיים בין גרגירי הג'ל. האחרון נקבע על ידי צפיפות האריזה וגיאומטריה של הגרגירים. עבור חלקיקים כדוריים, בצורה של אשר החומרים עבור כרומטוגרפיה ג'ל מיוצרים בדרך כלל, נפח חופשי הוא 30-35% של נפח הכולל של העמודה.

אם הממדים של מולקולות חלבון הם כך שהם יכולים לחדור לתוך הנקבוביות המהוות חלק מהגרגרים, עיכוב elution והחלבון יופיעו בכרך הקשורים למקדם הזמינות (נפח נפח הגרגירים זמין במולקולות) על ידי היחס:

כאשר V הוא נפח מלא של העמודה, מינוס חלק מצידה, אשר נופל על הג'ל עצמו להרכיב פולימר.

כל חלבון, בהתאם לגודל המולקולה, מתאים לערכו, שבו ההפרדה התבססה על כרומטוגרפיה ג'ל. ברור שאם נפח elution קרוב נפח חופשי, הוא מחפש אפס והפרדה של חלבונים, המולקולות של אשר כמעט לא נכלל ב ג 'ל נקבוביות, לא יקרה. כמו כן, המולקולות של גדלים קטנים שעבורם נפח הג'ל חודר (V קרוב ליחס ליחידה), בג'ל עם מאפיינים אלה אינם מחולקים. הרזולוציה הטובה ביותר מתקבלת אם היא נמצאת בטווח של 0.4 - 0.6. כמובן, גבולות ההפרדה ניתן להרחיב באמצעות חלבונים משקל גדולים מולקולריים, ועל ג 'ל קטן - קטן.

בהחלט, עם כרומטוגרפיה ג'ל, ההפרדה של חלבונים נקבעת על ידי משקל לא מולקולרי, אלא על ידי מידות גיאומטריות של המולקולה. לפיכך, המולקולות המוארכות עקב "נפילה" בפתרון קשה יותר לחדור לג'לים מאשר מולקולות כדוריות של אותו משקל מולקולרי. זה מסביר את elution מוקדם של חלבונים deatatured שהתנהגו כמו סבך רופף לא מסודר, ולא כמו כדור קומפקטי.

התלות הפשוטה בין המשקל המולקולרי של החלבון (הוגן, כמובן, רק למולקולות כדוריות קומפקטיות) וקלות הניסוי גרמה לג'ל כרומטוגרפיה עם שיטה מועדפת לקביעת המשקל המולקולרי של חלבונים. לשם כך, הטור מלא ג'ל המתאים הוא מכויל על ידי קבוצה של חלבונים עם משקולות מולקולריות ידועות, ולאחר מכן את elution של חלבון משומש נקבע אינטרפולציה המשקל המולקולרי שלה מחושב. הדיוק של השיטה אינו גדול מאוד, אבל הוא די מספיק עבור בעיות מעשיות ביותר.

בעת שימוש בשיטה זו, יש צורך לקחת בחשבון את המגבלות הנובעות בשל העובדה כי ג 'ל יוצר את החומר אינו די אינרטי, כפי שהוא מציע את התיאוריה של השיטה, והוא יכול לתקשר עם החומרים המופרדים, אשר מעוותים את תלות של נפח elution בגודל המולקולה. זה משפיע במיוחד על ההפרדה של כמויות קטנות של חלבון, שכן קיבולת הספיטה של \u200b\u200bמטריקס ג'ל הוא קטן ובניסויים בקנה מידה גדול, האינטראקציה שלה עם חלבון הוא קצת משתקף על התהליך.

חלבון מחייב על ידי ג 'ל יצירת חומרים יכול להיגרם על ידי אינטראקציות יון חילופי, בפרט, התוכן של קבוצות טעונה שלילית ב motrices polysaccharide (sefarose, sephadex), כמו גם בחומרים polyacrylamide. ב האחרון, carboxyl קבוצות להתרחש עם הידרוליזה ספונטנית של amides, הם יכולים ליצור polysaccharides כתוצאה של חמצון. העיכוב ב Chromatography ג 'ל נגרם על ידי יון חילופי אינטראקציות עם המטריצה \u200b\u200bאופייני במיוחד של חלבונים קטמי, כגון Lysozyme וכמה משנה משנה. לעתים קרובות זה מאוד משמעותי והוא יכול אפילו למנוע את ההפרדה של מלחים מן החלבון. בניסויים אנליטיים, ניתן לספק שימור כזה לעלייה משמעותית בכוח היוני של הפתרון.

סיבה נוספת לשמירה חריגה של חומרים תחת כרומטוגרפיה ג'ל מורגש במיוחד בבידוד של מולקולות קטנות, כגון פפטידים. - מחייב הידרופובי למטריקס ג'ל.

אלמנטים הידרופובים כלולים ב הידרופילי polysaccharide מטריצות בעת עיבוד הסוכנים שלהם crosslinking, במיוחד Epi-chlorohydrin, בסינתזה של Sephadex. פפטידים המכילים הידרופובי, במיוחד ארומטי, שאריות (phenylalaine, tryptophan) מוחזקים לפעמים על ידי מטריקס כל כך הרבה באופן משמעותי, אשר מופיעים באלימל מאוחר יותר מלחים אורגניים.

הרזולוציה של השיטה אינה גבוהה מאוד, במקביל לפשטות וברכות התנאים הניסוייים הם שלה יתרונות בלתי מעורערים. תחולת השיטה בשלבים הראשונים של טיהור מוגבלת על ידי העובדה כי עבור פסיון משביע רצון של חלבונים, נפח הפתרון יישומי לא צריך לעלות

3-5% מכלל העמודה. לאור זאת, כרומטוגרפיה ג'ל נקטה בדרך כלל באמצע או בשלבים הסופיים של הקצאת חלבון. כמובן, בעת הפרדת זיהומים משקל מולקולרי נמוך, בפרט במהלך התבטלות, נפח המדגם יכול להיות משמעותי יותר, שכן הוא אינו דורש ברזולוציה גבוהה. בגרסה פשוטה, סינון ג'ל משמש לעתים קרובות לעתים קרובות.

למרות המגבלות המצוינות, כרומטוגרפיה ג'ל היא דרך נוחה לחלבונים. הוא משמש גם להפריד בין חלבונים של זיהומים משקל מולקולרי נמוך, כולל מלחים.

לאחרונה, יחד עם ג 'ל יצירת חומרים להפרדת חלבונים בגודל, מקרביים אנאורגניים מדיה - זכוכית מקררופורית וסיליקה ג'ל. בדרך כלל, פני השטח של חומרים אלה מצופה חומרים אורגניים הידרופיליים לחסל את ספוגה בלתי הפיך של חלבונים. הנוקשות של חומרים אלה מאפשרת הפרדת חלבונים לפי גודל המולקולות כאשר לחצים מוגבריםכי מאיץ את התהליך ומקטין הפרעות מן הדיפוזיה.