Po extrakcii zmesi bielkovín z biologického materiálu sa rozdelí na jednotlivé proteínové frakcie. Bolo vyvinutých niekoľko spôsobov frakcionácie proteínov založených na rôznych fyzikálno-chemických vlastnostiach proteínov.

– ukladanie bielkovín v izoelektrickom bode - metóda je založená na vlastnosti proteínov v izoelektrickom bode zrážať sa v dôsledku neutralizácie náboja molekuly proteínu. Pre každý proteín je hodnota izoelektrického bodu striktne individuálna, preto je možné pomocou tejto metódy jednotlivé proteíny izolovať (ďalšie informácie o metóde nájdete v laboratórnej práci č. 3 v kurze „Biochémia“).

– frakcionácia bielkovín solením - na základe rozdielnej rozpustnosti proteínov v koncentrovaných roztokoch neutrálnych solí v závislosti od molekulovej hmotnosti (ďalšie informácie o metóde nájdete v laboratórnej práci č. 3 v kurze „Biochémia“).

– metóda elektroforetickej separácie bielkoviny na frakcie - opísané v časti o fyzikálno-chemických vlastnostiach bielkovín.

Okrem vyššie uvedených metód sa na separáciu proteínov na frakcie chromatografické metódy ... Najčastejšie sa používa stĺpcová chromatografia.

Znakom tejto metódy je, že zmes molekúl rôznych proteínov a peptidov sa nechá prejsť kolónou obsahujúcou pevný porézny materiál (matrica). Výsledkom interakcie s matricou sú rôzne proteíny, ktoré prechádzajú kolónou rôznymi rýchlosťami. Potom, čo sa proteíny v určitej sekvencii dostali na dno kolóny, zhromaždili sa v samostatných frakciách do skúmaviek.

Prideliť tri hlavné typy stĺpcová chromatografia:

– iónovú výmenu - na proteínovú chromatografiu sa používajú iónomeniče na báze celulózy alebo iných hydrofilných polymérov, napríklad dietylaminoetylcelulóza (DEAE celulóza) obsahujúca katiónové skupiny (negatívny náboj) alebo obsahujúca karboxymetylcelulózu (CM celulóza) obsahujúce amínové skupiny (pozitívny náboj):

Sila väzby proteínov s DEAE-celulózou je tým vyššia, čím viac karboxylových skupín v molekule proteínu je. Proteíny adsorbované na DEAE celulóze je možné z kolóny zmyť (eluovať) roztokmi so zvyšujúcou sa koncentráciou chloridu sodného. Spočiatku sú slabo viazané proteíny eluované a so zvyšujúcou sa koncentráciou solí sú eluované ďalšie proteíny, aby sa zvýšila ich afinita k DEAE celulóze.

KM celulóza sa používa podobne, ale afinita proteínov k nej je priamo úmerná počtu aminoskupín v molekule proteínu.

PH eluenta sa tiež zmení, aby sa odstránil naviazaný proteín.

– gélová filtračná chromatografia - má druhé meno „metóda molekulárneho sita“. Ako sitá sa používa Sephadex (polysacharid dextrán upravený hydridom epichloridu). Zrná Sephadexu napučiavajú vo vode a vytvárajú gél. Napučané granule majú póry určitého priemeru.

Táto separácia je založená na skutočnosti, že zrná Sephadexu (póry granúl) sú nepriepustné alebo obmedzené na látky s vysokou molekulovou hmotnosťou a malé molekuly voľne difundujú (prenikajú) do pórov zŕn.

Gélová hmota napučaného Sephadexu sa vloží do sklenenej kolóny (skúmavky), na povrch gélu sa nanesie vrstva proteínového roztoku (obr. 12, a) a potom sa kolónou nechá prejsť tlmivý roztok (elučná kvapalina). Proteíny prechádzajú kolónou medzi granulami, čím pomalšie, tým nižšia je ich molekulová hmotnosť, pretože proteínové molekuly s ešte nižšou molekulovou hmotnosťou ľahšie difundujú do granúl (do pórov) (obr. 12).

Obrázok: 12. Frakcionácia proteínov gélovou filtráciou

Proteíny sa z kolóny premyjú (elúujú) v poradí klesajúcej molekulovej hmotnosti. Následne sa najskôr eluujú veľké proteínové molekuly (obr. 12, b), ktoré nedifundujú do zŕn, potom malé molekuly a nakoniec nízkomolekulárne nečistoty.

Táto metóda sa používa nielen na frakcionáciu proteínov podľa molekulovej hmotnosti, ale aj na ich čistenie od nečistôt s nízkou molekulovou hmotnosťou.

– afinitná chromatografia - alebo afinitná chromatografia. Princíp metódy spočíva v tom, že dochádza k selektívnej interakcii proteínov so špecifickými látkami - ligandmi fixovanými na nosičoch (obr. 13).

Ako nosič sa používa sefaróza aktivovaná bromkyanom. Na sefarózu sa viažu ligandy rôzneho pôvodu - substrát alebo antigén alebo receptor, ktorý bude afinitne viazať iba jeden proteín zo zmesi:

- substrát → enzým;

- antigén → protilátka;

- hormón → receptor pre tento hormón.

Ostatné proteíny, ktoré sa neviažu na ligand, sa odstránia premytím kolóny.

Obrázok: 13. Mechanizmus afinitnej chromatografie

Afinitne viazaný proteín sa odstráni z kolóny použitím tlmivého roztoku (eluent). Do tlmivého roztoku sa pridá detergent, ktorý oslabuje väzby medzi proteínom a ligandom, alebo sa cez kolónu nechá prejsť roztok s vysokou koncentráciou voľného ligandu. V tomto prípade sa proteín ľahšie viaže na voľný ligand a je vymytý (eluovaný) z kolóny.

Analýza a izolácia peptidov (proteínov) 1.
Prípravné oddelenie - výber jedného alebo viacerých
zložky zmesi v individuálnom stave
2.
Analytická separácia - identifikačná a kvantitatívna
stanovenie zložiek v zmesi (vrátane chemických a
stereochemická čistota)
Analytická separácia môže predchádzať prípravnej
s cieľom zvoliť separačnú metódu a určiť jej optimálnu
podmienky.

Separačné metódy

Ako sa navzájom líšia proteíny (peptidy)?

Schematický diagram stĺpcovej chromatografie

Iónomeničová chromatografia

Iónomeničová chromatografia na CM celulóze

Hydrofóbna chromatografia

Afinitná chromatografia

Afinitná chromatografia C-reaktívneho proteínu

Gélová chromatografia (gélová filtrácia)

Elektroforéza

2-D elektroforéza

Chemošpecifická chromatografia

Názov

Izolácia a čistenie proteínov sa uskutočňuje v etapách.

1. Homogenizácia - Toto je dôkladné rozomletie predmetov biochemického výskumu na homogénny, to znamená homogénny stav, to znamená, že proteíny prechádzajú dôkladným rozpadom až do zničenia bunkovej steny.
V takom prípade používajú:
a) Homogenizátory nožov ako Warring;
b) piestikové homogenizátory Potter - Elwegeima;
v) guľové a valcové mlyny - na hustejšie predmety;
d) metóda striedavého zmrazovania a topenia, zatiaľ čo k rozbitiu bunkovej steny dochádza pôsobením ľadových kryštálov;
e) metóda „dusíková bomba“ - pod vysokým tlakom sú bunky nasýtené dusíkom, potom sa tlak náhle uvoľní, uvoľní sa plynný dusík, ktorý akoby explodoval bunku zvnútra;
e) Ultrazvuk, rôzne tlačové metódy, trávenie bunkových stien enzýmami. Vo väčšine prípadov sa teplo vytvára počas homogenizácie, zatiaľ čo veľa bielkovín sa môže inaktivovať, preto sa všetky postupy uskutočňujú v chladných miestnostiach pri teplote asi 0 ° C alebo sa surovina ochladzuje ľadom. Zároveň sa starostlivo kontroluje objem a čas deštrukcie buniek, pracovný tlak. Ideálny je homogenizovaný produkt, ktorý môže prejsť ďalšou extrakciou.

2. Extrakcia bielkovín, to znamená ich preklad do rozpusteného stavu; najčastejšie sa extrakcia uskutočňuje spolu s mletím súčasne.

Extrakcia sa vykonáva:
a) rozpustenie v 8 - 10% soľných roztokoch;
b) použitím tlmivých roztokov s pH od kyslého po mierne zásadité (boritan, fosfát, citrát, tris - pufor: zmes trisaminometánu s NH2 - CH3 + HCl;
v) zrážanie bielkovín organickými rozpúšťadlami (etanol, metanol, butanol, acetón a ich kombinácie), zatiaľ čo bielkovinové lipidy a bielkovinové bielkovinové zložky sú degradované, to znamená deštrukcia ChSB.

3. Čistenie a frakcionácia proteínov. Po extrakcii sa zmes rozdelí alebo rozdelí na jednotlivé proteíny a ich ďalšie čistenie:

a) solenie Je proces zrážania bielkovín neutrálnymi soľnými roztokmi alkalických kovov a kovov alkalických zemín.

Mechanizmus solenia - pridané anióny a katióny ničia hydratovaný proteínový obal bielkovín, čo je jeden z faktorov stability proteínových roztokov. Najbežnejšie používanými roztokmi sú síran sodný a amónny. Mnoho proteínov sa líši veľkosťou hydratačného obalu a výškou náboja. Každý proteín má svoju vlastnú zónu solenia. Po odstránení soliaceho činidla si proteín zachová svoju biologickú aktivitu a fyzikálno-chemické vlastnosti. V klinickej praxi sa metóda solenia používa na separáciu globulínov (keď sa pridá 50% roztok síranu amónneho (NH4) 2S04, vytvorí sa zrazenina) a albumínu (keď sa pridá 100% roztok síranu amónneho (NH4) 2S04, vytvorí sa zrazenina).

Na hodnotu solenia majú vplyv:
1) povaha a koncentrácia soli;
2) pH-prostredie;
3) teplota.

V tomto prípade hrajú hlavnú úlohu valencie iónov. Preto sa účinok soli hodnotí iónovou silou roztoku μ:

, to znamená, že iónová sila roztoku (μ) sa rovná súčinu ½ koncentrácie každého iónu (C) druhou mocninou jeho valencie (V).

Cohnova metóda je typ solenia. Súčasne prebieha extrakcia a zrážanie zložiek. Postupná zmena teploty (zvyčajne nízke t o –0 + 8 o C), pH roztoku a koncentrovaného etanolu, až 18 proteínových frakcií sa postupne izoluje z krvnej plazmy.

Cohnova metóda používané vo farmaceutickej výrobe na výrobu krvných náhrad;
b) chromatografické metódy... Ruský vedec Michail Tsvet (1903) je považovaný za zakladateľa vývoja chromatografických metód analýzy. V súčasnosti existuje veľa jeho odrôd. Metóda je založená na schopnosti látok špecificky sa adsorbovať na adsorbente uzavretom v kolóne alebo umiestnenom na akomkoľvek nosiči. V tomto prípade sa analyzované látky separujú a koncentrujú v striktne definovanej adsorpčnej vrstve. Potom sa kolónou prechádzajú príslušné eluenty (rozpúšťadlá), ktoré oslabujú adsorpčné sily a z kolóny vymývajú adsorbované látky. Látky sa zhromažďujú v zberači frakcií.

Základné pre chromatografiu je distribučný pomer, ktorá sa rovná pomeru koncentrácie látky v mobilná fáza na koncentráciu látky v stacionárna fáza (alebo stacionárna fáza).

Stacionárna stacionárna fáza - môže byť pevná alebo kvapalná alebo ako zmes pevnej a kvapalnej látky.

Mobilná fáza - kvapalný alebo plynný, stacionárne steká alebo cez ne prechádza.

V závislosti od typu stacionárnej a mobilnej fázy existujú rôzne modifikácie chromatografickej analýzy.

Adsorpcia - na základe rôznych stupňov adsorpcie proteínov adsorbentom a ich rozpustnosti vo vhodnom rozpúšťadle.

Aplikované adsorbenty - kyselina kremičitá, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, drevené uhlie. Adsorbent vo forme suspenzie s rozpúšťadlom (zvyčajne s pufrovacím roztokom) sa plní do kolóny (sklenená zvislá trubica). Vzorka sa nanesie na kolónu, potom sa cez ňu nechá prejsť rozpúšťadlo alebo zmes rozpúšťadiel.

Rozdelenie je založené na skutočnosti, že látky s vyššou distribúciou K. (B), pohybujte sa po kolóne vyššou rýchlosťou. Zber frakcií sa uskutočňuje pomocou zberača frakcií.

Deliaca chromatografia - na základe distribúcie zmesi bielkovín medzi dvoma kvapalnými fázami. Separácia sa môže uskutočňovať na špeciálnom chromatografickom papieri, ako aj v stĺpcoch, ako je tomu v prípade adsorpčného papiera. Tuhá fáza v tomto prípade slúži iba ako podpora pre kvapalnú stacionárnu fázu. Chromatografický papier má schopnosť zadržiavať vodu medzi svojimi celulózovými vláknami. Táto voda je stacionárna stacionárna fáza. Keď sa nevodné rozpúšťadlo (mobilná fáza) pohybuje na papieri pôsobením kapilárnych síl, molekuly látky nanesenej na papier sa rozdelia medzi dve fázy v súlade s ich distribučným koeficientom. Čím vyššia je rozpustnosť látky v mobilnej fáze, tým ďalej sa bude pohybovať pozdĺž papiera spolu s rozpúšťadlom.
V prípade chromatografickej distribúcie na kolóne sú nosičmi celulóza, škrob, silikagél atď., Stacionárnou fázou je voda. Po nanesení na kolónu sa zmesi pohybujú pozdĺž kolóny rôznymi rýchlosťami, berúc do úvahy Kraspr.

Rf je konštantná pre každú zlúčeninu za štandardných podmienok.
Iónomeničová chromatografia - založená na príťažlivosti opačne nabitých častíc. Na tento účel sa používajú rôzne iónomeničové živice: katexové živice - obsahujú negatívne nabité skupiny - sulfonované styrény a CMC, ktoré priťahujú kladne nabité ióny skúmaných látok. Tiež sa nazývajú kyslé iónomeniče.
Aniónové výmenné živice alebo bázické iónomeniče obsahujú pozitívne nabité skupiny, ktoré priťahujú negatívne nabité molekuly proteínu
Trimetylaminostirol je derivát styrénov a celulózy.
V závislosti na q proteínov, ktoré sa majú separovať, sa používajú vhodné iónomeniče, s ktorými určité proteíny interagujú, zatiaľ čo iné voľne opúšťajú kolónu. Proteíny „vyzrážané“ na kolóne sa odstránia použitím koncentrovanejších soľných roztokov alebo zmenou pH eluenta.
Afinitná chromatografia (alebo afinitná chromatografia) je založená na princípe selektívnej interakcie proteínov alebo iných makromolekúl so špecifickými látkami imobilizovanými na nosičoch - ligandoch (môže to byť koenzým, ak je izolovaný enzým, protilátka, antigén atď. Vzhľadom na vysokú špecifickosť proteínov voči imobilizovaným ligandom, iba jeden proteín zo zmesi. Premytý tlmivými zmesami so zmeneným pH alebo zmenenou iónovou silou.
Výhodou je schopnosť izolovať danú látku vysokej čistoty v jednom kroku.
Gélová filtrácia alebo metóda molekulárneho sita je typ permeačnej chromatografie.
Delenie molekúl podľa veľkosti a tvaru je založené na vlastnostiach molekulárneho sita, ktoré majú mnohé pórovité materiály, ako sú napríklad organické polyméry s trojrozmernou sieťovou štruktúrou, ktorá im dáva vlastnosti gélov. Gélová filtrácia je separácia látok pomocou gélov na základe rozdielov v molekulárnej veľkosti (Sepharose, Sephadex, Sephacryl, biogély atď.). Pôsobením epichlórhydrínu sú polysacharidové reťazce dextránu (syntetizované mikroorganizmami) zosieťované do sieťovej štruktúry, stanú sa nerozpustnými vo vode, ale zachovávajú si k nej veľkú afinitu. Z dôvodu tejto hydrofilnosti výsledné zrná (nazývané Sephadex) silne napučiavajú a vytvárajú gél, ktorý sa plní do kolóny. Metóda je založená na skutočnosti, že veľké molekuly nepreniknú do vnútornej vodnej fázy, zatiaľ čo menšie molekuly najskôr preniknú do pórov „sita“, akoby sa do nich zasekli, a preto sa pohybujú nižšou rýchlosťou. V súlade s tým sú proteíny s vyššou Mr vstupné do prijímača prvé. V poslednej dobe sa pórovité sklenené guľôčky čoraz viac používajú v penetračnej chromatografii ako molekulárne sitá.
Elektroforetická metóda v biochémii je založená na rozdiele v rýchlosti pohybu molekúl v elektrickom poli (aminokyseliny, peptidy, proteíny, nukleové kyseliny).
Rozdiel v cestovnej rýchlosti závisí od:
1.z q molekuly: čím väčšie je celkové q, tým väčšia je mobilita molekúl. Hodnota q závisí od pH;
2. na veľkosť molekúl: čím väčšie sú molekuly, tým menšia je ich mobilita. Je to spôsobené zvýšením trecích síl a elektrostatickými interakciami veľkých molekúl s prostredím;
3. na tvare molekúl: molekuly rovnakej veľkosti, ale rôznych tvarov, napríklad fibrily a proteínové guľôčky majú rôznu rýchlosť. Je to spôsobené rozdielmi v sile trenia a elektrostatickej interakcii.
Druhy elektroforézy
a) Izoelektrické zaostrovanie. K separácii dochádza na zvislom stĺpci v stupňov. pH aj napätie. Pomocou špeciálnych nosičov amfolytov sa v kolóne ustanovuje krupobitie. pH od 0 do 14. Do kolóny sa vloží zmes látok, pripájam elektrický prúd. Každá zo zložiek sa presunie do tej časti kolóny, kde hodnota pH zodpovedá jej izoelektrickému bodu, a zastaví sa tam, to znamená, že je zameraná.
Výhoda: separácia, čistenie a identifikácia proteínov sa uskutočňuje v jednom kroku. Metóda má vysoké rozlíšenie (0,02 pI).
b) Izotachoforéza je elektroforéza na podporných médiách. Po zapnutí elektrického prúdu sa ióny s najvyššou mobilitou presunú najskôr na zodpovedajúcu elektródu, pričom najnižšia - posledná s medzilehlou mobilitou - sa nachádza v strede.
c) Disková elektroforéza - prístroj sa skladá z dvoch nádob s pufrom - hornej a dolnej, spojených vertikálnymi trubicami obsahujúcimi viacpórový gél. Keď sa ionizované častice pohybujú pôsobením elektrického prúdu. Vyššia pórovitosť je na vrchu gélu.
d) Imunoelektroforéza - metóda kombinujúca elektroforézu s imunodifúziou (na detekciu antigénov v komplexných fyziologických zmesiach). Zmes antigénov a zmes protilátok sa umiestni na špeciálny nosič kolmo na seba. Keď sa zapne elektrický prúd, rozdelia sa na jednotlivé látky a difundujú na gélovom nosiči. V mieste stretnutia antigénu so zodpovedajúcou protilátkou dôjde k špecifickej zrážacej reakcii vo forme oblúka. Počet vytvorených oblúkov zodpovedá počtu antigénov.

Metódy stanovenia Mr proteínov

Pre veľké množstvo bielkovín nebolo stanovené chemické zloženie a poradie aminokyselín (1010–1012 bielkovín), preto Mr. Používa sa celý rad metód.
a) Sedimentačná metóda - stanovenie Mr sa vykonáva v špeciálnych odstredivkách (prvá odstredivka bola navrhnutá švédskym biochemikom Svedbergom), v ktorých je možné vytvoriť odstredivé zrýchlenie, ktoré je 200-tisíckrát alebo viacnásobkom zrýchlenia zemskej gravitácie. Mr je určený V sedimentáciou molekúl. Keď sa molekuly pohybujú od stredu k periférii, vytvára sa ostré rozhranie proteín-rozpúšťadlo. Sedimentačná rýchlosť je vyjadrená sedimentačnou konštantou (S):

kde V je rýchlosť pohybu hranice proteínu a rozpúšťadla (cm / s);
 - uhlová rýchlosť rotora (rad / s);
 - vzdialenosť od stredu rotora do stredu bunky s proteínovým roztokom (cm).
Hodnota sedimentačnej konštanty S, ktorá je 110–13 С, sa obvykle berie ako 1 a nazýva sa 1 Svedberg (S). S pre proteíny leží v rozmedzí 1 - 50 S, niekedy až 100 S.
Mr bielkovín je určený Švédbergovou rovnicou:

kde R je univerzálna plynová konštanta;
T je absolútna teplota v Kelvinoch;
S - sedimentačná konštanta;
D je difúzny koeficient;
 je hustota rozpúšťadla;
V je čiastočný špecifický objem plynu.
Táto metóda je drahá z dôvodu použitého hardvéru.
Jednoduchšie a lacnejšie:
b) Gélová filtrácia v tenkej vrstve Sephadexu.
Dĺžka dráhy proteínu (v mm) je logaritmická s Mr.
X - Mr cieľového proteínu na kalibračnom grafe.
c) Disková elektroforéza v polyakrylamidovej vrstve - existuje tiež vzťah medzi logaritmom Mr kalibračných proteínov a ich dĺžkou dráhy.

Metódy stanovenia homogenity bielkovín

Čistota izolovaného proteínu je určená:

• ultracentrifugácia;
• disková metóda - elektroforéza;
• rôzne imunochemické metódy;
• stanovenie rozpustnosti proteínov (Northropova metóda) je založené na fázovom pravidle, podľa ktorého rozpustnosť čistej látky za daných experimentálnych podmienok závisí iba od teploty, ale nezávisí od koncentrácie látky v tuhej fáze.

Ak je bielkovina homogénna, potom sa v grafe (a) získa jedna inflexia, ak sú v nej nečistoty proteínov (b, c), dostaneme niekoľko inflexií saturačnej krivky. Všetky proteíny majú svoje vlastné individuálne krivky rozpustnosti.

Po extrakcii zmesi bielkovín z biologického materiálu sa rozdelí na jednotlivé proteínové frakcie. Bolo vyvinutých niekoľko spôsobov frakcionácie proteínov založených na rôznych fyzikálno-chemických vlastnostiach proteínov.

– ukladanie bielkovín v izoelektrickom bode - metóda je založená na vlastnosti proteínov v izoelektrickom bode zrážať sa v dôsledku neutralizácie náboja molekuly proteínu. Pre každý proteín je hodnota izoelektrického bodu striktne individuálna, preto je možné pomocou tejto metódy jednotlivé proteíny izolovať (ďalšie informácie o metóde nájdete v laboratórnej práci č. 3 v kurze „Biochémia“).

– frakcionácia bielkovín solením - na základe rozdielnej rozpustnosti proteínov v koncentrovaných roztokoch neutrálnych solí v závislosti od molekulovej hmotnosti (ďalšie informácie o metóde nájdete v laboratórnej práci č. 3 v kurze „Biochémia“).

– metóda elektroforetickej separácie bielkoviny na frakcie - opísané v časti o fyzikálno-chemických vlastnostiach bielkovín.

Okrem vyššie uvedených metód sa na separáciu proteínov na frakcie chromatografické metódy ... Najčastejšie sa používa stĺpcová chromatografia.

Znakom tejto metódy je, že zmes molekúl rôznych proteínov a peptidov sa nechá prejsť kolónou obsahujúcou pevný porézny materiál (matrica). Výsledkom interakcie s matricou sú rôzne proteíny, ktoré prechádzajú kolónou rôznymi rýchlosťami. Potom, čo sa proteíny v určitej sekvencii dostali na dno kolóny, zhromaždili sa v samostatných frakciách do skúmaviek.

Prideliť tri hlavné typy stĺpcová chromatografia:

– iónovú výmenu - na proteínovú chromatografiu sa používajú iónomeniče na báze celulózy alebo iných hydrofilných polymérov, napríklad dietylaminoetylcelulóza (DEAE celulóza) obsahujúca katiónové skupiny (negatívny náboj) alebo obsahujúca karboxymetylcelulózu (CM celulóza) obsahujúce amínové skupiny (pozitívny náboj):

Sila väzby proteínov s DEAE-celulózou je tým vyššia, čím viac karboxylových skupín v molekule proteínu je. Proteíny adsorbované na DEAE celulóze je možné z kolóny zmyť (eluovať) roztokmi so zvyšujúcou sa koncentráciou chloridu sodného. Spočiatku sú slabo viazané proteíny eluované a so zvyšujúcou sa koncentráciou solí sú eluované ďalšie proteíny, aby sa zvýšila ich afinita k DEAE celulóze.

KM celulóza sa používa podobne, ale afinita proteínov k nej je priamo úmerná počtu aminoskupín v molekule proteínu.

PH eluenta sa tiež zmení, aby sa odstránil naviazaný proteín.

– gélová filtračná chromatografia - má druhé meno „metóda molekulárneho sita“. Ako sitá sa používa Sephadex (polysacharid dextrán upravený hydridom epichloridu). Zrná Sephadexu napučiavajú vo vode a vytvárajú gél. Napučané granule majú póry určitého priemeru.

Táto separácia je založená na skutočnosti, že zrná Sephadexu (póry granúl) sú nepriepustné alebo obmedzené na látky s vysokou molekulovou hmotnosťou a malé molekuly voľne difundujú (prenikajú) do pórov zŕn.

Gélová hmota napučaného Sephadexu sa vloží do sklenenej kolóny (skúmavky), na povrch gélu sa nanesie vrstva proteínového roztoku (obr. 12, a) a potom sa kolónou nechá prejsť tlmivý roztok (elučná kvapalina). Proteíny prechádzajú kolónou medzi granulami, čím pomalšie, tým nižšia je ich molekulová hmotnosť, pretože proteínové molekuly s ešte nižšou molekulovou hmotnosťou ľahšie difundujú do granúl (do pórov) (obr. 12).

Obrázok: 12. Frakcionácia proteínov gélovou filtráciou

Proteíny sa z kolóny premyjú (elúujú) v poradí klesajúcej molekulovej hmotnosti. Následne sa najskôr eluujú veľké proteínové molekuly (obr. 12, b), ktoré nedifundujú do zŕn, potom malé molekuly a nakoniec nízkomolekulárne nečistoty.

Táto metóda sa používa nielen na frakcionáciu proteínov podľa molekulovej hmotnosti, ale aj na ich čistenie od nečistôt s nízkou molekulovou hmotnosťou.

– afinitná chromatografia - alebo afinitná chromatografia. Princíp metódy spočíva v tom, že dochádza k selektívnej interakcii proteínov so špecifickými látkami - ligandmi fixovanými na nosičoch (obr. 13).

Ako nosič sa používa sefaróza aktivovaná bromkyanom. Na sefarózu sa viažu ligandy rôzneho pôvodu - substrát alebo antigén alebo receptor, ktorý bude afinitne viazať iba jeden proteín zo zmesi:

- substrát → enzým;

- antigén → protilátka;

- hormón → receptor pre tento hormón.

Ostatné proteíny, ktoré sa neviažu na ligand, sa odstránia premytím kolóny.

Obrázok: 13. Mechanizmus afinitnej chromatografie

Afinitne viazaný proteín sa odstráni z kolóny použitím tlmivého roztoku (eluent). Do tlmivého roztoku sa pridá detergent, ktorý oslabuje väzby medzi proteínom a ligandom, alebo sa cez kolónu nechá prejsť roztok s vysokou koncentráciou voľného ligandu. V tomto prípade sa proteín ľahšie viaže na voľný ligand a je vymytý (eluovaný) z kolóny.

Na akých fyzikálno-chemických vlastnostiach proteínov môžu byť založené spôsoby ich separácie? Po prvé, je to veľkosť molekuly, jej geometria. Metódy gélovej chromatografie a ultrafiltrácie, čiastočne elektroforézy v géloch, sú založené na použití tejto vlastnosti.

Po druhé, distribúcia nabitých skupín charakteristických pre daný proteín na jeho povrchu . Pomer katiónových a aniónových skupín v proteíne sa mení v závislosti od pH, izoelektrické body proteínov - pI (hodnoty pH, pri ktorých sú pozitívne a negatívne náboje proteínu úplne kompenzované a celkový náboj je nulový) sa pre rôzne proteíny významne líšia. Je známe, že proteíny sú za fyziologických podmienok katiónové, aniónové alebo molekuly bez zreteľnej prevahy nad jedným alebo iným nábojom. Rozdiel v náboji proteínov pri rôznom pH je založený na ich separácii elektroforézou, izoelektrickou fokusáciou, izoelektrickou a iónomeničovou chromatografiou. Dôležitý však nie je iba pomer nabitých skupín, ktorý určuje hodnotu pI. Proteíny s podobnými izoelektrickými bodmi sa môžu líšiť v distribúcii nabitých funkčných skupín po povrchu glóbusu. Posledné menované sú umiestnené viac-menej rovnomerne; naopak, vytvárajú lokálne zahusťovanie, zväzky rovnako nabitých skupín, čo ovplyvňuje iónomeničovú chromatografiu proteínu.

Po tretie, proteíny sa líšia počtom a povahou hydrofóbnych povrchových plôch, čo sa používa pri hydrofóbnej chromatografii

Upozorňujeme, že žiadna z vyššie uvedených vlastností nemôže sama osebe zabezpečiť izoláciu individuálneho proteínu z komplexnej zmesi - sú nedostatočne charakteristické a nezaručujú selektivitu čistenia. V tomto ohľade oveľa nádejnejšia

na zvýraznenie funkčných vlastností proteínu. V skutočnosti je medzi mnohými proteínmi vo východiskovom materiáli veľa takých, ktoré majú podobnú molekulovú hmotnosť alebo blízke izoelektrické body, ale počet napríklad fosfatáz alebo amyláz bude určite malý. Je zrejmé, že izolačná metóda založená na použití schopnosti týchto enzýmov interagovať s ich špecifickým substrátom je neporovnateľne selektívnejšia ako akákoľvek metóda založená na rozdiele vo fyzikálno-chemických vlastnostiach.

Schémy izolácie proteínov, ktoré využívajú iba jeden princíp, sú zriedkavé, zvyčajne sa rôzne prístupy k frakcionácii kombinujú a navzájom sa dopĺňajú.

Separácia proteínov podľa molekulovej hmotnosti. Gélová chromatografia (gélová filtrácia)

Pri tejto metóde sa používajú granulované gély zosieťované hydrofilné materiály, napr. dextrán (Sephadex, Sepharose a ich analógy), polyakrylamid (biogély a ich analógy), polyvinylalkohol (toyoperl). Granule sú tvorené trojrozmernou polymérnou sieťou, ktorá je nepriepustná pre veľké molekuly, čiastočne priepustná pre molekuly strednej veľkosti a dobre priepustná pre malé molekuly, soli a vodu. V závislosti na priemernej veľkosti buniek polymérneho gélu a geometrii molekuly je k dispozícii väčšia alebo menšia časť celkového objemu gélových granúl.

Keď sa roztok obsahujúci proteíny a ďalšie molekuly pohybuje pozdĺž kolóny naplnenej napučanými gélovými granulami, sú v nej zadržané zložky zmesi, ktoré prenikli do gélu. Zaostávajú teda za väčšími molekulami, ktoré nemôžu vstúpiť do granúl, a sú iba v roztoku, ktorý ich premýva. Bez toho, aby boli obsiahnuté v géli, sa v eluáte objavia veľké molekuly, akonáhle kolónou prejde „voľný“ objem roztoku, ktorý sa rovná objemu roztoku obsiahnutého medzi gélovými guľôčkami. Posledné menované je určené hustotou balenia a geometriou granúl. Pre sférické častice, vo forme ktorých sa obvykle vyrábajú materiály pre gélovú chromatografiu, predstavuje voľný objem 30 - 35% z celkového objemu kolóny.

Ak je veľkosť molekúl proteínu taká, že môžu preniknúť do pórov, ktoré tvoria určitú časť objemu granúl, dôjde k oneskoreniu elúcie a proteín sa objaví v objeme Ve, čo súvisí s koeficientom prístupnosti (zlomkom objemu granúl dostupným pre daný typ molekuly) v pomere:

kde V je celkový objem kolóny mínus jej časť, ktorá padá na samotný gélotvorný polymér.

Každý proteín má v závislosti od veľkosti svojej molekuly svoju vlastnú hodnotu, na ktorej bola založená separácia pri gélovej chromatografii. Je zrejmé, že ak je elučný objem blízky voľnému objemu, potom má tendenciu k nule a nedôjde k separácii proteínov, ktorých molekuly prakticky nevstupujú do pórov gélu. Rovnakým spôsobom sa malé molekuly, pre ktoré je priepustný celý objem gélu (Ve je blízko a má sklon k jednote), v géle s týmito vlastnosťami neoddelia. Najlepšie rozlíšenie sa získa, ak je v rozmedzí 0,4 - 0,6. Samozrejme, separačné limity je možné predĺžiť použitím gélov s veľkými pórmi pre proteíny s vysokou molekulovou hmotnosťou a gélov s jemnými pórmi pre malé proteíny.

Striktne povedané, v gélovej chromatografii sa separácia proteínov neurčuje podľa molekulovej hmotnosti, ale podľa geometrických rozmerov molekuly. Podlhovasté molekuly teda v dôsledku "salto" v roztoku prenikajú do gélov ťažšie ako sférické molekuly s rovnakou molekulovou hmotnosťou. To vysvetľuje skorú elúciu denaturovaných proteínov, ktoré sa správajú skôr ako neusporiadaná voľná guľa ako kompaktná guľa.

Jednoduchý vzťah medzi elučným objemom a molekulovou hmotnosťou proteínu (platný, samozrejme, iba pre kompaktné sférické molekuly) a ľahký experiment urobili z gélovej chromatografie preferovanú metódu na stanovenie molekulovej hmotnosti proteínov. Na tento účel sa kolóna naplnená vhodným gélom kalibruje sadou proteínov so známymi molekulovými hmotnosťami, potom sa stanoví elučný objem študovaného proteínu a jeho molekulová hmotnosť sa vypočíta interpoláciou. Presnosť metódy nie je príliš vysoká, ale na väčšinu problémov, ktoré sa prakticky vyskytujú, je úplne dostačujúca.

Pri použití tejto metódy je potrebné vziať do úvahy obmedzenia vyplývajúce zo skutočnosti, že gél tvoriaci materiál nie je úplne inertný, ako to naznačuje teória metódy, a môže interagovať s látkami, ktoré sa majú separovať, čo narúša závislosť elučného objemu od veľkosti molekuly. To platí najmä pri separácii malého množstva proteínu, pretože sorpčná kapacita gélovej matrice je nízka a pri pokusoch vo veľkom meradle má jeho interakcia s proteínom malý vplyv na postup.

Väzba proteínov pomocou gélotvorných materiálov môže byť spôsobená iónomeničovými interakciami, najmä obsahom negatívne nabitých skupín v polysacharidových matriciach (Sepharose, Sephadex), ako aj v polyakrylamidových materiáloch. V druhom prípade karboxylové skupiny vznikajú pri spontánnej hydrolýze amidov, zatiaľ čo v polysacharidoch môžu vznikať v dôsledku oxidácie. Oneskorenie gélovej chromatografie spôsobené iónomeničovými interakciami s matricou je zvlášť charakteristické pre katiónové proteíny, ako je lyzozým a niektoré subtilizíny. Je často dosť významný a môže dokonca interferovať s oddeľovaním solí od bielkovín. V analytických experimentoch možno takúto retenciu potlačiť významným zvýšením iónovej sily roztoku.

Ďalším dôvodom abnormálneho zadržiavania látok pri gélovej chromatografii, ktorý je zvlášť zreteľný pri izolácii malých molekúl, ako sú peptidy. - hydrofóbna väzba na gélovú matricu.

Hydrofóbne prvky sú zahrnuté v hydrofilné polysacharidové matrice pri spracovaní zosieťovacími činidlami, najmä epi-chlórhydrínom, pri syntéze Sephadexu. Peptidy obsahujúce hydrofóbne, najmä aromatické zvyšky (fenylalaiín, tryptofán) sú matricou niekedy zadržané tak významne, že sa v eluáte objavia neskôr ako anorganické soli.

Rozlíšenie metódy nie je príliš vysoké, jeho nespornými výhodami sú zároveň jednoduchosť priebehu a mäkkosť experimentálnych podmienok. Použiteľnosť metódy v prvých stupňoch čistenia je obmedzená skutočnosťou, že pre uspokojivú frakcionáciu bielkovín by objem aplikovaného roztoku nemal prekročiť

3 - 5% z celkového objemu kolóny. Z tohto hľadiska sa gélová chromatografia zvyčajne uchýli k strednej alebo konečnej fáze izolácie proteínu. Samozrejme, pri separácii nízkomolekulárnych nečistôt, najmä počas odsoľovania, môže byť objem vzorky oveľa väčší, pretože nie je potrebné vysoké rozlíšenie. V tejto zjednodušenej forme sa zvlášť často používa gélová filtrácia.

Napriek týmto obmedzeniam je gélová chromatografia pohodlnou metódou na frakcionáciu proteínov. Používa sa tiež na oddelenie nízkomolekulárnych nečistôt od bielkovín vrátane solí.

V poslednej dobe, spolu s gélotvornými materiálmi na separáciu proteínov podľa veľkosti, makroporéznymi anorganickými nosiče - makroporézne sklo a silikagél. Zvyčajne je povrch týchto materiálov potiahnutý hydrofilnými organickými látkami, aby sa vylúčila ireverzibilná sorpcia proteínov. Tuhosť týchto materiálov umožňuje oddelenie proteínov podľa veľkosti molekúl pri zvýšenom tlaku, čo urýchľuje proces a znižuje difúznu interferenciu.