Miután a fehérjék keverékét biológiai anyagból extrahálták, az egyes fehérjefrakciókra oszlik. Számos fehérjefrakcionálási módszert dolgoztak ki, amelyek a fehérjék különböző fizikai-kémiai tulajdonságain alapulnak.

– a fehérjék lerakódása az izoelektromos ponton - a módszer azon alapul, hogy a fehérjék az izoelektromos pontban kicsapódnak a fehérjemolekula töltésének semlegesítése miatt. Minden fehérje esetében az izoelektromos pont értéke szigorúan egyedi, ezért ezzel a módszerrel lehetőség van az egyes fehérjék izolálására (a módszerről további részletekért lásd a "Biokémia" tanfolyam 3. számú laboratóriumi munkáját).

– a fehérjék frakcionálása sózással - a fehérjék eltérő oldhatósága a semleges sók koncentrált oldataiban, a molekulatömegtől függően (a módszerről bővebben lásd a "Biokémia" tanfolyam 3. számú laboratóriumi munkáját).

– elektroforetikus elválasztási módszer fehérjék frakciónként - a szakaszban ismertetjük fiziokémiai tulajdonságok fehérjék.

A fent bemutatott módszerek mellett a fehérjék frakciókra történő szétválasztására kromatográfiás módszerek ... Oszlopkromatográfiát alkalmaznak leggyakrabban.

Ennek a módszernek az a sajátossága, hogy a különféle fehérjék és peptidek molekuláinak keverékét szilárd porózus anyagot (mátrixot) tartalmazó oszlopon vezetik át. A mátrixszal való kölcsönhatás eredményeként a különböző fehérjék különböző sebességgel haladnak át az oszlopon. Miután a fehérjék egy bizonyos sorrendben elérték az oszlop alját, külön frakciókban gyűjtjük össze kémcsövekbe.

Kioszt három fő típus oszlopkromatográfia:

– ioncsere - fehérjekromatográfiához cellulózon vagy más hidrofil polimeren alapuló ioncserélőket alkalmaznak, például kationos csoportokat tartalmazó negatív töltésű vagy amincsoportokat tartalmazó pozitív oxigén-tartalmú karboxi-metil-cellulózt (pozitív töltés) tartalmazó dietil-amino-etil-cellulóz (DEAE cellulóz):

A fehérjék DEAE-cellulózzal való megkötésének ereje nagyobb, annál több karboxilcsoport található a fehérjemolekulában. A DEAE cellulózra adszorbeált fehérjék az oszlopról növekvő koncentrációjú nátrium-klorid oldatokkal moshatók (eluálhatók). Először lazán kötött fehérjék eluálódnak, és a sókoncentráció növekedésével más fehérjék is eluálódnak, a DEAE cellulóz iránti affinitásuk növelése érdekében.

A KM-cellulózt hasonló módon használják, de a fehérjék iránti affinitása egyenesen arányos a fehérjemolekulában lévő aminocsoportok számával.

A kötött fehérje eltávolításához az eluens pH-ját is megváltoztatják.

– gélszűrő kromatográfia - második neve "molekulaszita módszer". Szitákként Sephadex-et (epiklorid-hidrinnel kezelt poliszacharid-dextránt) használunk. A Sephadex szemcsék vízben megduzzadnak és gélt képeznek. A duzzadt szemcséknek bizonyos átmérőjű pórusai vannak.

A szétválasztás azon a tényen alapul, hogy a Sephadex szemcsék (a szemcsék pórusai) áthatolhatatlanok vagy korlátozottan áteresztőek a nagy molekulatömegű anyagok számára, és a kis molekulák szabadon diffundálnak (behatolnak) a szemcsék pórusaiba.

A duzzadt Sephadex gélszerű tömegét üvegoszlopba (csőbe) helyezzük, fehérjeoldat-réteget viszünk fel a gél felületére (12. ábra, a), majd pufferoldatot (elúciós folyadék) vezetünk át. az oszlopon keresztül. A fehérjék a granulátumok közötti oszlop mentén haladnak lassabban, annál kisebb a molekulatömegük, mivel a még kisebb molekulatömegű fehérjemolekulák könnyebben diffundálnak a szemcsékbe (a pórusokba) (12. ábra).

Ábra. 12. A fehérjék frakcionálása gélszűréssel

A fehérjéket az oszlopról csökkenő molekulatömeg-sorrendben mossuk (eluáljuk). Következésképpen először nagy fehérjemolekulákat eluálnak (12. ábra, b), amelyek nem diffundálnak szemcsékké, majd kis molekulákká és végül kis molekulájú szennyeződésekké.

Ezt a módszert nemcsak a fehérjék molekulatömeg szerinti frakcionálására használják, hanem kis molekulatömegű szennyeződésekből történő tisztításukra is.

– affinitáskromatográfia - vagy affinitáskromatográfia. A módszer alapelve, hogy a fehérjék szelektív kölcsönhatásban vannak specifikus anyagokkal - a hordozókhoz kapcsolt ligandumok (13. ábra).

Vivőanyagként cianogén-bromiddal aktivált szefarózt használnak. Különböző eredetű ligandumok kapcsolódnak a szefarózhoz - szubsztráthoz, antigénhez vagy receptorhoz, amelyek csak egy fehérjét kötnek meg affinitással a keverékből:

- szubsztrát → enzim;

- antigén → antitest;

- hormon → receptor erre a hormonra.

A ligandumhoz nem kötött egyéb fehérjéket az oszlop mosásával távolítjuk el.

Ábra. 13. Az affinitáskromatográfia mechanizmusa

Az affinitáshoz kötött fehérjét pufferoldattal (eluens) távolítjuk el az oszlopból. A pufferhez mosószert adnak, amely gyengíti a fehérje és a ligandum közötti kötéseket, vagy egy oldatot, amelyben nagy koncentrációban van szabad ligandum, vezetünk át az oszlopon. Ebben az esetben a fehérje könnyebben kötődik a szabad ligandumhoz, és az oszlopból kimossák (eluálják).

A peptidek (fehérjék) elemzése és izolálása
Előkészítő elválasztás - egy vagy több kiválasztása
keverékkomponensek egyedi állapotban
2.
Analitikai elválasztás - azonosítás és mennyiségi meghatározás
komponensek meghatározása keverékben (beleértve a vegyi és a kémiai anyagokat is)
sztereokémiai tisztaság)
Az analitikai elválasztás megelőzheti a preparatív folyamatot
az elválasztási módszer kiválasztása és annak optimális meghatározása érdekében
körülmények.

Elválasztási módszerek

Miben különböznek a fehérjék (peptidek) egymástól?

Az oszlopkromatográfia sematikus diagramja

Ioncserélő kromatográfia

Ioncserélő kromatográfia CM-cellulózon

Hidrofób kromatográfia

Affinitáskromatográfia

C-reaktív fehérje affinitáskromatográfiája

Gélkromatográfia (gélszűrés)

Elektroforézis

2-D elektroforézis

Kemospecifikus kromatográfia

Cím

A fehérjék izolálását és tisztítását szakaszosan hajtják végre.

1. Homogenizálás Van egy alapos köszörülés tárgyakat biokémiai kutatás homogén, azaz homogén állapotba, vagyis a fehérjék a sejtfal elpusztulásáig alapos szétesésen mennek keresztül.
Ebben az esetben a következőket használják:
de) Késhomogenizátorok, mint a Warring;
b) bibe homogenizátorok Potter - Elwegeima;
ban ben) golyós- és görgősmalmok - sűrűbb tárgyakhoz;
d) a fagyasztás és felolvasztás váltakozó módszere, miközben a sejtfal repedése jégkristályok hatására következik be;
e)"nitrogénbomba" módszere - alatt magas nyomású a sejteket nitrogénnel telítik, majd a nyomás hirtelen felszabadul, nitrogéngáz szabadul fel, amely mintegy felrobbanja a sejtet belülről;
e) Ultrahang, különféle sajtolási módszerek, a sejtfalak emésztése enzimekkel. A legtöbb esetben a hő a homogenizálás során keletkezik, miközben sok fehérje inaktiválható, ezért minden eljárást hideg helyiségekben végeznek t 0 ° -on, vagy az alapanyagot jéggel hűtik. Ugyanakkor gondosan ellenőrzik a sejtek pusztulásának mennyiségét és idejét, az üzemi nyomást. Az ideális egy homogenizált termék, amely további extrakciónak vethető alá.

2. Fehérjék kivonása, vagyis azok oldott állapotba történő fordítása; leggyakrabban az extrakciót egyidejűleg darálással végzik.

Az extrakciót:
de) oldás 8-10% sóoldatokban;
b) pufferoldatokat használunk, amelyek pH-ja savas vagy enyhén lúgos (borát, foszfát, citrát, triszpuffer: triszaminometán és NH2 - CH3 + HCl keveréke;
ban ben) fehérjék kicsapása szerves oldószerekkel (etanol, metanol, butanol, aceton és ezek kombinációi), míg a fehérje-lipid és fehérje-fehérje komponensek lebomlanak, vagyis a CHSB megsemmisül.

3. Fehérjék tisztítása és frakcionálása. Az extrakció után az elegyet elválasztjuk vagy frakcionáljuk egyedi fehérjékké és további tisztításukra:

a) kisózás A fehérjék kicsapásának folyamata alkáli- és alkáliföldfémek semleges sóoldataival.

Sótalanító mechanizmus- a hozzáadott anionok és kationok elpusztítják a fehérjék hidratált fehérjehéját, ami a fehérjeoldatok stabilitásának egyik tényezője. A Na és az ammónium-szulfátok leggyakrabban használt oldatai. Sok fehérje különbözik a hidratáló héj méretétől és a töltés nagyságától. Minden fehérjének megvan a maga kisózási zónája. A kisózó szer eltávolítása után a fehérje megőrzi biológiai aktivitását és fizikai-kémiai tulajdonságait. BAN BEN klinikai gyakorlat a kisózási módszert alkalmazzák a globulinok elválasztására (ha 50% -os ammónium-szulfát (NH 4) 2SO 4 oldatot adunk hozzá, csapadék képződik) és az albumint (amikor 100% -os ammónium-szulfát (NH 4) 2SO 4 oldatot adunk hozzáadódik, csapadék képződik).

A kisózási értéket befolyásolják:
1) a só jellege és koncentrációja;
2) pH-környezet;
3) hőmérséklet.

Ebben az esetben az ionok vegyértékeinek van a főszerepük. Ezért a só hatását az μ oldat ionerősségével értékelik:

azaz az oldat (μ) ionerőssége megegyezik az egyes ionok (C) koncentrációjának szorzatával annak vegyértékének (V) négyzetével.

Cohn módszere egyfajta kisózás. A komponensek extrahálása és kicsapása egyszerre történik. A hőmérséklet (általában alacsony t o –0 + 8 o C), az oldat és a koncentrált etanol pH-jának egymás utáni megváltoztatásával akár 18 fehérjefrakciót lehet egymástól elkülöníteni a vérplazmától.

Cohn módszere gyógyszerkészítményekben vérpótlók előállítására használják;
b) kromatográfiás módszerek... Az orosz tudós, Mihail Tsvet (1903) tekinthető a kromatográfiai elemzési módszerek kifejlesztésének alapítójának. Jelenleg sokféle változata van. A módszer azon alapul, hogy az anyagok képesek specifikusan adszorbeálódni egy oszlopba zárt vagy bármely hordozóra helyezett adszorbensen. Ebben az esetben az analitokat elválasztják és koncentrálják egy szigorúan meghatározott adszorbens rétegben. Ezután a megfelelő eluenseket (oldószereket) átengedjük az oszlopon, amelyek gyengítik az adszorpciós erőket és kimossák az adszorbeált anyagokat az oszlopból. Az anyagokat a frakciógyűjtőben gyűjtik össze.

A kromatográfiában alapvető eloszlási arány, amely megegyezik az anyag koncentrációjának arányával mobil fázis az anyag koncentrációjához állófázis(vagy állófázis).

Helyhez kötött álló fázis- lehet szilárd vagy folyékony, vagy szilárd és folyékony keverék.

Mobil fázis- folyékony vagy gáznemű, álló helyzetben folyik, vagy áthalad rajta.

Az álló és a mozgó fázis típusától függően a kromatográfiás elemzés különféle módosításokat végezhet.

Adszorpció- alapján változó mértékben a fehérjék adszorpciója adszorpcióval és oldhatóságuk megfelelő oldószerben.

Alkalmazott adszorbensek - kovasav, Al 2 O 3, CaCO 3, MgO, szén. Az oldószerrel (általában pufferoldattal) készített szuszpenzió formájában lévő adszorbenset oszlopba (függőleges üvegcső) csomagolják. A mintát az oszlopra visszük fel, majd egy oldószert vagy oldószerelegyet vezetünk át rajta.

A felosztás azon a tényen alapul, hogy a magasabb K eloszlású anyagok. (B) nagyobb sebességgel haladjon az oszlop mentén. A frakciók gyűjtését a frakciógyűjtővel végezzük.

Partíciókromatográfia- fehérjekeverék két folyékony fázis közötti megoszlása ​​alapján. Az elválasztás történhet speciális kromatográfiás papíron, valamint oszlopokban, mint az adszorpciós papírban. A szilárd fázis ebben az esetben csak a folyékony állófázis alátámasztására szolgál. A kromatográfiai papír képes visszatartani a vizet cellulózszálai között. Ez a víz egy álló helyzetű fázis. Amikor egy nem vizes oldószer (mozgó fázis) kapilláris erők hatására mozog a papíron, akkor a papírra felvitt anyag molekulái eloszlási együtthatójuknak megfelelően oszlanak meg a két fázis között. Minél nagyobb az anyag oldhatósága a mobil fázisban, annál tovább mozog a papír mentén az oldószerrel együtt.
Oszlopon végzett kromatográfiai eloszlás esetén a hordozók cellulóz, keményítő, szilikagél stb., Az állófázis víz. Ha az oszlopra kerül, a keverékek az oszlop mentén mozognak különböző sebességű figyelembe véve Kraszpr.

Rf minden csatlakozáshoz szabványos feltételek az érték állandó.
Ioncserélő kromatográfia - ellentétesen töltött részecskék vonzása alapján. Ehhez különféle ioncserélő gyantákat használnak: kationcserélő gyanták - negatív töltésű csoportokat tartalmaznak - szulfonált sztirolok és CMC, amelyek vonzzák a vizsgált anyagok pozitív töltésű ionjait. Sav-ioncserélőknek is nevezik őket.
Az anioncserélő gyanták vagy bázikus ioncserélők pozitív töltésű csoportokat tartalmaznak, amelyek vonzzák a negatív töltésű fehérjemolekulákat
A trimetil-amino-sztirol a sztirolok és a cellulóz származéka.
Az elválasztandó fehérjék q értékétől függően megfelelő ioncserélőket alkalmazunk, amelyekkel bizonyos fehérjék kölcsönhatásba lépnek, míg mások szabadon elhagyják az oszlopot. Az oszlopon "kicsapódott" fehérjéket töményebb sóoldatokkal vagy az eluens pH-jának megváltoztatásával távolítjuk el.
Az affinitáskromatográfia (vagy affinitáskromatográfia) a fehérjék vagy más makromolekulák és a hordozókra immobilizált specifikus anyagokkal való szelektív kölcsönhatás elvén alapul (ligandumok) (ez lehet koenzim, ha enzimet izolálnak, az antitest csak antigén stb.) a keverék egy fehérje Megváltozott pH-értékű vagy megváltozott ionerősségű pufferkeverékekkel.
Előnye az a képesség, hogy egy adott tisztaságú anyagot egyetlen lépésben izolálhatunk.
A gélszűrés vagy a molekulaszita módszer a permeációs kromatográfia egyik típusa.
A molekulák méret és alak szerinti szétválasztása azon molekulaszita tulajdonságokon alapul, amelyek sok porózus anyaggal rendelkeznek, például háromdimenziós hálózati szerkezetű szerves polimerek, amelyek megadják számukra a gélek tulajdonságait. A gélszűrés az anyagok szétválasztása gélek alkalmazásával a molekula méretbeli különbségek alapján (Sepharose, Sephadex, Sephacryl, biogélek stb.). Az epiklórhidrin hatására a dextrán (mikroorganizmusok által szintetizált) poliszacharid-láncai térhálósodnak egy hálózati struktúrába, vízben oldhatatlanná válnak, de nagy affinitást tartanak fenn iránt. Ennek a hidrofilitásnak a következtében a kapott szemcsék (az úgynevezett Sephadex) erősen megduzzadva gélt képeznek, amely az oszlopba töltődik. A módszer azon a tényen alapul, hogy a nagy molekulák nem hatolnak be a belső vizes fázisba, míg a kisebb molekulák először a "szita" pórusaiba hatolnak be, mintha megakadnának bennük, és ezért kisebb sebességgel mozognak. Ennek megfelelően a magasabb Mr értékű fehérjék lépnek be először a vevőbe. A közelmúltban a porózus üveggyöngyöket egyre inkább molekuláris szitákként használják a penetrációs kromatográfiában.
A biokémiai elektroforetikus módszer a molekulák elektromos térben (aminosavak, peptidek, fehérjék, nukleinsavak).
A menetsebesség különbsége a következőktől függ:
1.a molekula q-tól: minél nagyobb az össz q, annál nagyobb a molekulák mobilitása. A q értéke a pH-tól függ;
2. a molekulák méretén: minél nagyobbak a molekulák, annál kisebb a mozgékonyságuk. Ennek oka a súrlódási erők és a nagy molekulák elektrosztatikus kölcsönhatásainak növekedése környezet;
3.molekulák alakjától: molekulák azonos méretű de különféle alakú például a fibrilláknak és a fehérje gömböknek különböző az aránya. Ennek oka a súrlódási erők és az elektrosztatikus kölcsönhatások eltérései.
Az elektroforézis típusai
a) Izoelektromos fókuszálás. Az elválasztás függőleges oszlopon történik deg. mind a pH, mind a feszültség. Az amfolitok speciális hordozóinak segítségével jégeső jön létre az oszlopban. pH értéke 0-tól 14-ig. Az oszlopba anyagok keverékét helyezzük, elektromos áramot csatlakoztatok. Az egyes komponensek az oszlopnak arra a részére költöznek, ahol a pH-érték megfelel annak izoelektromos pontjának, és ott megáll, vagyis összpontosít.
Előny: a fehérjék szétválasztása, tisztítása és azonosítása egy lépésben történik. A módszer nagy felbontású (0,02 pI).
b) Az izotachoforézis a táptalajokon végzett elektroforézis. Az elektromos áram bekapcsolása után a legnagyobb mozgékonyságú ionok először a megfelelő elektródához mozognak, a legalacsonyabbak - az utolsók közepes mozgékonyságúak - középen helyezkednek el.
c) Lemezelektroforézis - az eszköz két edényből áll, pufferrel - felső és alsó, többporos gélt tartalmazó függőleges csövekkel összekötve. Ahogy az ionizált részecskék elektromos áram hatására mozognak. Nagyobb porozitás van a gél tetején.
d) Immunelektroforézis - az elektroforézist immunodiffúzióval ötvöző módszer (antigének kimutatására komplex fiziológiai keverékekben). Antigének keverékét és antitestek keverékét egy speciális, egymásra merőleges hordozóra helyezzük. Az elektromos áram bekapcsolásakor különálló anyagokra válnak szét és diffúziósak egy gélhordozón. Az antigén és a megfelelő antitest találkozási pontjában egy specifikus kicsapódási reakció ív formájában történik. A kialakult ívek száma megfelel az antigének számának.

Módszerek a Mr fehérjék meghatározására

Nagyszámú fehérje esetében nem állapították meg az aminosavak kémiai összetételét és szekvenciáját (1010–1012 fehérje), ezért Mr. Ennek során különféle módszereket alkalmaznak.
a) Ülepítési módszer - Mr meghatározása speciális centrifugákban történik (az első centrifugát Svedberg svéd biokémikus javasolta), amelyben lehetőség van centrifugális gyorsulás létrehozására, amely 200 vagy többszöröse a gravitáció gyorsulásának. Mr-t a molekulák V ülepedése határozza meg. Amint a molekulák a központból a perifériára mozognak, éles fehérje-oldószer határfelület alakul ki. Az ülepedési sebességet az ülepedési állandó (S) formájában fejezzük ki:

ahol V a fehérje-oldószer határ mozgásának sebessége (cm / s);
 - a rotor szögsebessége (rad / s);
 - távolság a rotor közepétől a sejt közepéig a fehérjeoldattal (cm).
Az S ülepedési állandó értékét, amely 110–13 С, hagyományosan 1-nek vesszük, és 1 Svedberg-nek (S) nevezzük. A fehérjék S értéke az 1-50 S, néha 100 S tartományba esik.
A fehérjék Mr értékét a Swedberg egyenlet határozza meg:

ahol R az univerzális gázállandó;
T az abszolút hőmérséklet Kelvinben;
S az ülepedési állandó;
D a diffúziós együttható;
 az oldószer sűrűsége;
V a gáz részleges fajlagos térfogata.
Ez a módszer drága az érintett hardver miatt.
Egyszerűbb és olcsóbb:
b) Gélszűrés vékony Sephadex rétegben.
A fehérjeút hossza (mm-ben) logaritmikus Mr.
X - a célfehérje Mr a kalibrációs grafikonon.
c) Lemezelektroforézis poliakrilamidrétegben - összefüggés van a kalibrációs fehérjék Mr logaritmusa és útjának hossza között is.

Módszerek a fehérje homogenitásának meghatározására

Az izolált fehérje tisztaságát a következők határozzák meg:

• ultracentrifugálás;
• lemezes módszer - elektroforézis;
• különféle immunokémiai módszerek;
• A fehérjeoldékonyság meghatározása (Northrop-módszer) a fázisszabályon alapszik, amely szerint egy tiszta anyag oldhatósága adott kísérleti körülmények között csak a hőmérséklettől függ, de nem függ az anyag szilárd fázisban lévő koncentrációjától.

Ha a fehérje homogén, akkor a grafikon egy (a) inflexiót mutat be, ha fehérjék szennyeződései vannak (b, c), akkor a telítettségi görbe több inflexióját kapjuk. Minden fehérjének megvannak a maga oldhatósági görbéi.

Miután a fehérjék keverékét biológiai anyagból extrahálták, az egyes fehérjefrakciókra oszlik. Számos fehérjefrakcionálási módszert dolgoztak ki, amelyek a fehérjék különböző fizikai-kémiai tulajdonságain alapulnak.

– a fehérjék lerakódása az izoelektromos ponton - a módszer azon alapul, hogy a fehérjék az izoelektromos pontban kicsapódnak a fehérjemolekula töltésének semlegesítése miatt. Minden fehérje esetében az izoelektromos pont értéke szigorúan egyedi, ezért ezzel a módszerrel lehetőség van az egyes fehérjék izolálására (a módszerről további részletekért lásd a "Biokémia" tanfolyam 3. számú laboratóriumi munkáját).

– a fehérjék frakcionálása sózással - a fehérjék eltérő oldhatósága a semleges sók koncentrált oldataiban, a molekulatömegtől függően (a módszerről bővebben lásd a "Biokémia" tanfolyam 3. számú laboratóriumi munkáját).

– elektroforetikus elválasztási módszer fehérjék frakciókká - a fehérjék fizikai-kémiai tulajdonságairól szóló szakaszban ismertetjük.

A fent bemutatott módszerek mellett a fehérjék frakciókra történő szétválasztására kromatográfiás módszerek ... Oszlopkromatográfiát alkalmaznak leggyakrabban.

Ennek a módszernek az a sajátossága, hogy a különféle fehérjék és peptidek molekuláinak keverékét szilárd porózus anyagot (mátrixot) tartalmazó oszlopon vezetik át. A mátrixszal való kölcsönhatás eredményeként a különböző fehérjék különböző sebességgel haladnak át az oszlopon. Miután a fehérjék egy bizonyos sorrendben elérték az oszlop alját, külön frakciókban gyűjtjük össze kémcsövekbe.

Kioszt három fő típus oszlopkromatográfia:

– ioncsere - fehérjekromatográfiához cellulózon vagy más hidrofil polimeren alapuló ioncserélőket alkalmaznak, például kationos csoportokat tartalmazó negatív töltésű vagy amincsoportokat tartalmazó pozitív oxigén-tartalmú karboxi-metil-cellulózt (pozitív töltés) tartalmazó dietil-amino-etil-cellulóz (DEAE cellulóz):

A fehérjék DEAE-cellulózzal való megkötésének ereje nagyobb, annál több karboxilcsoport található a fehérjemolekulában. A DEAE cellulózra adszorbeált fehérjék az oszlopról növekvő koncentrációjú nátrium-klorid oldatokkal moshatók (eluálhatók). Először lazán kötött fehérjék eluálódnak, és a sókoncentráció növekedésével más fehérjék is eluálódnak, a DEAE cellulóz iránti affinitásuk növelése érdekében.

A KM-cellulózt hasonló módon használják, de a fehérjék iránti affinitása egyenesen arányos a fehérjemolekulában lévő aminocsoportok számával.

A kötött fehérje eltávolításához az eluens pH-ját is megváltoztatják.

– gélszűrő kromatográfia - második neve "molekulaszita módszer". Szitákként Sephadex-et (epiklorid-hidrinnel kezelt poliszacharid-dextránt) használunk. A Sephadex szemcsék vízben megduzzadnak és gélt képeznek. A duzzadt szemcséknek bizonyos átmérőjű pórusai vannak.

A szétválasztás azon a tényen alapul, hogy a Sephadex szemcsék (a szemcsék pórusai) áthatolhatatlanok vagy korlátozottan áteresztőek a nagy molekulatömegű anyagok számára, és a kis molekulák szabadon diffundálnak (behatolnak) a szemcsék pórusaiba.

A duzzadt Sephadex gélszerű tömegét üvegoszlopba (csőbe) helyezzük, fehérjeoldat-réteget viszünk fel a gél felületére (12. ábra, a), majd pufferoldatot (elúciós folyadék) vezetünk át. az oszlopon keresztül. A fehérjék a granulátumok közötti oszlop mentén haladnak lassabban, annál kisebb a molekulatömegük, mivel a még kisebb molekulatömegű fehérjemolekulák könnyebben diffundálnak a szemcsékbe (a pórusokba) (12. ábra).

Ábra. 12. A fehérjék frakcionálása gélszűréssel

A fehérjéket az oszlopról csökkenő molekulatömeg-sorrendben mossuk (eluáljuk). Következésképpen először nagy fehérjemolekulákat eluálnak (12. ábra, b), amelyek nem diffundálnak szemcsékké, majd kis molekulákká és végül kis molekulájú szennyeződésekké.

Ezt a módszert nemcsak a fehérjék molekulatömeg szerinti frakcionálására használják, hanem kis molekulatömegű szennyeződésekből történő tisztításukra is.

– affinitáskromatográfia - vagy affinitáskromatográfia. A módszer alapelve, hogy a fehérjék szelektív kölcsönhatásban vannak specifikus anyagokkal - a hordozókhoz kapcsolt ligandumok (13. ábra).

Vivőanyagként cianogén-bromiddal aktivált szefarózt használnak. Különböző eredetű ligandumok kapcsolódnak a szefarózhoz - szubsztráthoz, antigénhez vagy receptorhoz, amelyek csak egy fehérjét kötnek meg affinitással a keverékből:

- szubsztrát → enzim;

- antigén → antitest;

- hormon → receptor erre a hormonra.

A ligandumhoz nem kötött egyéb fehérjéket az oszlop mosásával távolítjuk el.

Ábra. 13. Az affinitáskromatográfia mechanizmusa

Az affinitáshoz kötött fehérjét pufferoldattal (eluens) távolítjuk el az oszlopból. A pufferhez mosószert adnak, amely gyengíti a fehérje és a ligandum közötti kötéseket, vagy egy oldatot, amelyben nagy koncentrációban van szabad ligandum, vezetünk át az oszlopon. Ebben az esetben a fehérje könnyebben kötődik a szabad ligandumhoz, és az oszlopból kimossák (eluálják).

A fehérjék milyen fizikai-kémiai jellemzőin alapulhatnak az elválasztás módszerei? Először is, ez a molekula mérete, geometriája. A gélkromatográfia és az ultraszűrés, részben a gélekben történő elektroforézis módszerei ezen funkció használatán alapulnak.

Másodszor, az adott fehérjére jellemző töltött csoportok megoszlása a felszínén . A fehérje kationos és anionos csoportjainak aránya a pH-tól, a fehérjék izoelektromos pontjaitól függően változik - pI (pH-értékek, amelyeknél a fehérje pozitív és negatív töltése teljesen kompenzálódik, és az összes töltés egyenlő nulla) jelentősen különböző fehérjék esetében. A fehérjék ismertek abban, hogy fiziológiai körülmények között kationosak, anionosak vagy molekulák vannak, egyik vagy másik töltés észrevehető túlsúlya nélkül. Elektroforézissel, izoelektromos fókuszálással, izoelektromos és ioncserélő kromatográfiával történő elválasztásuk a különböző pH-értékű fehérjék töltésének különbségén alapul. Azonban nem csak a töltött csoportok aránya határozza meg a pI értékét. A hasonló izoelektromos pontokkal rendelkező fehérjék különbözhetnek a töltött funkcionális csoportok eloszlásában a gömb felületén. Ez utóbbiak nagyjából egyenletesen helyezkednek el; éppen ellenkezőleg, helyi sűrűsödéseket, egyformán töltött csoportok csomóit képezik, ami befolyásolja a fehérje ioncserélő kromatográfiáját.

Harmadszor, a fehérjék különböznek a hidrofób felületi területek számától és jellegétől, mit használnak a hidrofób kromatográfiában

Megjegyezzük, hogy a fentiekben figyelembe vett tulajdonságok egyike sem képes önmagában biztosítani az egyes fehérjék izolálását egy komplex keverékből - ezek nem eléggé jellemzőek és nem garantálják a tisztítási szelektivitást. Sokkal ígéretesebb e tekintetben

használja a fehérje funkcionális tulajdonságainak kiemelésére. Valójában a kiindulási anyagban található sok fehérje között sok hasonló molekulatömegű vagy szoros izoelektromos pont van, de például a foszfatázok vagy az amilázok száma minden bizonnyal kicsi lesz. Nyilvánvaló, hogy az izolálási módszer, amely ezen enzimek azon képességének felhasználására épül, hogy kölcsönhatásba lépnek a specifikus szubsztrátumukkal, összehasonlíthatatlanul szelektívebb, mint bármelyik módszer, amely a fizikai-kémiai tulajdonságok különbségén alapul.

A csak egy elvet alkalmazó fehérje-izolációs sémák ritkák, általában a frakcionálás különböző megközelítései kombinálódnak és kiegészítik egymást.

A fehérjék szétválasztása molekulatömeg szerint. Gélkromatográfia (gélszűrés)

Ez a módszer szemcsés géleket használ térhálós hidrofil anyagok, például dextrán (Sephadex, Sepharose és analógjaik), poliakrilamid (biogélek és analógjaik), polivinil-alkohol (toyoperl). A granulátumokat egy háromdimenziós polimer hálózat alkotja, amely át nem ereszkedik a nagy molekulákra, részben átjárja a közepes méretű molekulákat, és jól átereszti a kis molekulákat, sókat és vizet. A polimer gél átlagos sejtméretétől és az utóbbi molekulájának geometriájától függően a gélgranulátum teljes térfogatának többé-kevésbé elérhető.

Amikor a fehérjéket és más molekulákat tartalmazó oldat megduzzadt gélgranulátumokkal töltött oszlop mentén mozog, a keverék gélbe behatolt komponensei benne maradnak. Így elmaradnak a nagyobb molekuláktól, amelyek nem tudnak bejutni a szemcsékbe, és csak az oldatban mossák őket. Anélkül, hogy a gélbe kerülnének, nagy molekulák jelennek meg az eluátumban, amint egy "szabad" oldatmennyiség áthalad az oszlopon, egyenlő a gélgyöngyök közötti oldat térfogatával. Ez utóbbit a csomagolási sűrűség és a granulátumok geometriája határozza meg. Gömb alakú részecskék esetében, amelyek formájában általában gélkromatográfiás anyagokat állítanak elő, a szabad térfogat a teljes oszloptérfogat 30-35% -a.

Ha a fehérjemolekulák mérete olyan, hogy be tudnak hatolni a pórusokba, amelyek a granulátum térfogatának bizonyos részét alkotják, akkor késleltetésre kerül az eluálás, és a fehérje megjelenik a Ve térfogatban, az elérési együtthatóval társítva ( az adott típusú molekulához rendelkezésre álló granulátum térfogatának aránya) az arány szerint:

ahol V az oszlop teljes térfogata, levonva annak a részét, amely magára a gélképző polimerre esik.

Minden fehérjének, a molekula méretétől függően, megvan a maga értéke, amelyen a gélkromatográfiás elválasztás alapult. Nyilvánvaló, hogy ha az elúciós térfogat közel van a szabad térfogathoz, akkor ez nullára hajlamos, és nem következik be olyan fehérjék szétválasztása, amelyek molekulái gyakorlatilag nem jutnak be a gél pórusaiba. Hasonlóképpen, az ilyen jellemzőkkel rendelkező gélben lévő kis molekulák, amelyek esetében a gél teljes térfogata átjárható (a Ve közel van az egységhez és hajlamos az egységre). A legjobb felbontás akkor érhető el, ha 0,4 - 0,6 tartományban van. Természetesen az elválasztási határok kitágíthatók nagy pórusú gélek alkalmazásával a nagy molekulatömegű fehérjékhez és a finom pórusú gélek kicsihez.

Szigorúan véve a gélkromatográfiában a fehérjék elválasztását nem a molekulatömeg, hanem a molekula geometriai méretei határozzák meg. Ennek megfelelően a hosszúkás molekulákat - az oldatban "bukdácsolás" miatt - nehezebb behatolni a gélekbe, mint az azonos molekulatömegű gömbös molekulákat. Ez magyarázza a denaturált fehérjék korai elúcióját, amelyek rendezetlen laza gömbként viselkednek, nem pedig kompakt gömbként.

Az elúciós térfogat és a fehérje molekulatömege közötti egyszerű kapcsolat (természetesen csak kompakt gömbmolekulákra érvényes) és a kísérlet egyszerűsége tette a gélkromatográfiát a fehérjék molekulatömegének meghatározásának előnyös módszerévé. Ebből a célból egy megfelelő géllel töltött oszlopot kalibrálunk ismert molekulatömegű fehérjék készlettel, majd meghatározzuk a vizsgált fehérje elúciós térfogatát, és interpolációval kiszámoljuk annak molekulatömegét. A módszer pontossága nem túl magas, de a gyakorlatban felmerülő problémák többségéhez elégséges.

E módszer alkalmazásakor figyelembe kell venni azokat a korlátozásokat, amelyek abból fakadnak, hogy az anyagot képező gél nem teljesen inert, amint azt a módszer elmélete javasolja, és kölcsönhatásba léphet az elválasztandó anyagokkal, ami torzít az elúciós térfogat függése a molekula méretétől. Ez különösen befolyásolja a kis mennyiségű fehérje szétválasztását, mivel a gélmátrix szorpciós képessége alacsony, és nagyszabású kísérletek során a fehérjével való kölcsönhatása csekély hatást gyakorol a folyamatra.

A fehérjék megkötését gélképző anyagokkal ioncserélő kölcsönhatások okozhatják, különösen a negatív töltésű csoportok tartalma a poliszacharid mátrixokban (Sepharose, Sephadex), valamint a poliakrilamid anyagokban. Ez utóbbiban a karboxilcsoportok az amidok spontán hidrolízise során keletkeznek, míg a poliszacharidokban oxidáció eredményeként képződhetnek. A gélkromatográfia késése, amelyet a mátrixszal folytatott ioncserélő kölcsönhatások okoznak, különösen jellemző a kationos fehérjékre, például a lizozimra és néhány szubtilizinre. Gyakran elég jelentős, sőt zavarhatja a sók fehérjétől való elválasztását. Analitikai kísérletek során az ilyen retenciót az oldat ionerősségének jelentős növelésével lehet elnyomni.

Az anyagok rendellenes retenciójának másik oka a gélkromatográfiában, különösen észrevehető kis molekulák, például peptidek izolálásakor. - hidrofób kötődés a gélmátrixhoz.

A hidrofób elemek szerepelnek a hidrofil poliszacharid mátrixok térhálósító szerekkel, különösen epi-klórhidrinnel kezelve, a Sephadex szintézisében. A hidrofób, különösen aromás maradékokat (fenil-alayin, triptofán) tartalmazó peptideket a mátrix néha olyan jelentős mértékben visszatartja, hogy később jelenjenek meg az eluátumban, mint a szervetlen sók.

A módszer felbontása nem túl nagy, ugyanakkor a magatartás egyszerűsége és a kísérleti körülmények lágysága vitathatatlan előnyök... A módszer alkalmazhatóságát a tisztítás első szakaszában korlátozza az a tény, hogy a fehérjék kielégítő frakcionálásához az alkalmazott oldat térfogata nem haladhatja meg

A teljes oszloptérfogat 3-5% -a. Ennek fényében a gélkromatográfiát általában a fehérjeizoláció közepén vagy az utolsó szakaszában alkalmazzák. Természetesen az alacsony molekulatömegű szennyeződések szétválasztásakor, különösen a sótalanítás során, a minta térfogata sokkal nagyobb lehet, mivel nem szükséges nagy felbontás. Ebben az egyszerűsített formában a gélszűrést különösen gyakran használják.

Ezen korlátozások ellenére a gélkromatográfia kényelmes módszer a fehérjék frakcionálására. Használják a kis molekulatömegű szennyeződések és a fehérjék, köztük a sók elkülönítésére is.

A közelmúltban a fehérjék méret szerinti szétválasztására szolgáló gélképző anyagokkal együtt makropórusos szervetlen hordozók - makropórusos üveg és szilikagél. Ezeknek az anyagoknak a felületét általában hidrofil szerves anyagokkal vonják be a fehérjék irreverzibilis szorbciójának kizárása érdekében. Ezen anyagok merevsége lehetővé teszi a fehérjék molekulaméret szerinti elválasztását, amikor nagy nyomás, amely felgyorsítja a folyamatot és csökkenti a diffúziós interferenciát.