После экстракции смеси белков из биологического материала проводят ее разделение на индивидуальные фракции белков. Разработано несколько методов фракционирования белков, основанных на различных физико-химических свойствах белков.

– осаждение белков в изоэлектрической точке – в основе метода лежит свойство белков в изоэлектрической точке выпадать в осадок вследствие нейтрализации заряда белковой молекулы. Для каждого белка значение изоэлектрической точки строго индивидуально, поэтому данным методом возможно выделение индивидуальных белков (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).

– фракционирование белков методом высаливания – основано на различной растворимости белков в концентрированных растворах нейтральных солей, в зависимости от молекулярной массы (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).

– метод электрофоретического разделения белков на фракции – описан в разделе физико-химические свойства белков.

Кроме представленных выше методов для разделения белков на фракции широко используют хроматографические методы . Чаще всего используют колоночную хроматографию.

Особенностью данного метода является то, что смесь молекул различных белков и пептидов пропускают через колонку, содержащую твердый пористый материал (матрикс). В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями в пробирки.

Выделяют три основных вида колоночной хроматографии:

– ионообменная – для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров, например, диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза), содержащую катионные группы (отрицательный заряд) или содержащую карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлоза), содержащую аминные группы (положительный заряд):

Прочность связывания белков с ДЭАЭ-целлюлозой тем выше, чем больше в молекуле белка карбоксильных групп. Белки, адсорбированные на ДЭАЭ-целлюлозе, можно смыть (элюировать) из колонки растворами с возрастающей концентрацией хлорида натрия. Вначале элюируются слабосвязанные белки, а по мере увеличения концентрации соли и другие белки, в порядке возрастания их сродства к ДЭАЭ-целлюлозе.

Аналогично применяют и КМ-целлюлозу, но сродство белков к ней прямо пропорционально числу аминогрупп в молекуле белка.

Для снятия связанного белка также изменяют рН элюента.

– хроматография гель-фильтрацией – имеет второе название «метод молекулярных сит». В качестве сит используют сефадекс (полисахарид декстран, обработанный эпихлоридгидрином). Зерна сефадекса набухают в воде и образуют гель. Набухшие гранулы имеют поры определенного диаметра.

Разделение основано на том, что зерна сефадекса (поры гранул) непроницаемы или ограничено проницаемы для веществ с большой молекулярной массой, а небольшие молекулы свободно диффундируют (проникают) в поры зерен.

Гелеобразную массу набухшего сефадекса помещают в стеклянную колонку (трубку), на поверхности геля наносят слой белкового раствора (рис. 12, а) и затем через колонку пропускают буферный раствор (элюирующая жидкость). Белки проходят вдоль колонки между гранулами тем медленнее, чем меньше их молекулярная масса, так как молекулы белков с еще меньшей молекулярной массой легче диффундируют внутрь гранул (в поры) (рис. 12).

Рис. 12. Фракционирование белков методом гель-фильтрации

Белки вымываются (элюируются) из колонки в порядке убывания молекулярной массы. Следовательно, первыми элюируются крупные белковые молекулы (рис. 12, б), которые не диффундируют в зерна, затем мелкие молекулы и в последнюю очередь низкомолекулярные примеси.

Этот метод применяют не только для фракционирования белков по молекулярной массе, но и для очистки их от низкомолекулярных примесей.

– аффинная хроматография – или хроматография по сродству. Принцип метода заключается в том, что происходит избирательное взаимодействие белков со специфическими веществами – лигандами, закрепленными на носителях (рис. 13).

В качестве носителя используют активированную бромцианом сефарозу. К сефарозе присоединяют лиганды различного происхождения – субстрат, или антиген, или рецептор, которые будут афинно связывать только один белок из смеси:

– субстрат → фермент;

– антиген → антитело;

– гормон → рецептор данного гормона.

Другие белки, не связавшиеся с лигандом, удаляются путем промывания колонки.

Рис. 13. Механизм аффинной хроматографии

Снятие с колонки афинно закрепленного белка осуществляется с помощью буферного раствора (элюента). В состав буфера вводят детергент, который ослабляет связи между белком и лигандом, или через колонку пропускают раствор с высокой концентрацией свободного лиганда. В этом случае белок легче связывается со свободным лигандом и вымывается (элюируется) из колонки.

Анализ и выделение пептидов (белков)1.
Препаративное разделение – выделение одного или нескольких
компонентов смеси в индивидуальном состоянии
2.
Аналитическое разделение – идентификация и количественное
определение компонентов в смеси (в том числе химическая и
стереохимическая чистота)
Аналитическое разделение может предшествовать препаративному
с целью выбора метода разделения и определения его оптимальных
условий.

Методы разделения

Чем белки (пептиды) отличаются друг от друга?

Принципиальная схема колоночной хроматографии

Ионнообменная хроматография

Ионнообменная хроматография на СМ-целлюлозе

Гидрофобная хроматография

Афинная хроматография

Афинная хроматография С-реактивного белка

Гель-хроматография (гель-фильтрация)

Электорофорез

2-D электрофорез

Хемоспецифическая хроматография

Заголовок

Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.

1. Гомогенизация – это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а) ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б) пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в) шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г) метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д) метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е) УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.

2. Экстракция белков , то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.

Экстракцию проводят:
а) растворением в 8-10% растворах солей;
б) с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в) осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.

3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:

а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.

Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок).

На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.

Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:

, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).

Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t o –0+8 o С), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.

Метод Кона применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии . Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.

Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения , который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе ).

Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.

Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.

В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.

Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.

Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al 2 О 3 , CaCO 3 , MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.

Разделение основано на том, что вещества с более высоким К распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.

Распределительная хроматография – основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.

Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.

Методы определения Mr белков

У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):

где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
 – угловая скорость ротора (рад/с);
 – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
 – плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.

Методы определения гомогенности белков

Степень чистоты выделенного белка определяется:

• ультрацентрифугированием;
• методом диск - электрофореза;
• различными иммунохимическими методами;
• определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.

Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.

После экстракции смеси белков из биологического материала проводят ее разделение на индивидуальные фракции белков. Разработано несколько методов фракционирования белков, основанных на различных физико-химических свойствах белков.

– осаждение белков в изоэлектрической точке – в основе метода лежит свойство белков в изоэлектрической точке выпадать в осадок вследствие нейтрализации заряда белковой молекулы. Для каждого белка значение изоэлектрической точки строго индивидуально, поэтому данным методом возможно выделение индивидуальных белков (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).

– фракционирование белков методом высаливания – основано на различной растворимости белков в концентрированных растворах нейтральных солей, в зависимости от молекулярной массы (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).

– метод электрофоретического разделения белков на фракции – описан в разделе физико-химические свойства белков.

Кроме представленных выше методов для разделения белков на фракции широко используют хроматографические методы . Чаще всего используют колоночную хроматографию.

Особенностью данного метода является то, что смесь молекул различных белков и пептидов пропускают через колонку, содержащую твердый пористый материал (матрикс). В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями в пробирки.

Выделяют три основных вида колоночной хроматографии:

– ионообменная – для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров, например, диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза), содержащую катионные группы (отрицательный заряд) или содержащую карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлоза), содержащую аминные группы (положительный заряд):

Прочность связывания белков с ДЭАЭ-целлюлозой тем выше, чем больше в молекуле белка карбоксильных групп. Белки, адсорбированные на ДЭАЭ-целлюлозе, можно смыть (элюировать) из колонки растворами с возрастающей концентрацией хлорида натрия. Вначале элюируются слабосвязанные белки, а по мере увеличения концентрации соли и другие белки, в порядке возрастания их сродства к ДЭАЭ-целлюлозе.

Аналогично применяют и КМ-целлюлозу, но сродство белков к ней прямо пропорционально числу аминогрупп в молекуле белка.

Для снятия связанного белка также изменяют рН элюента.

– хроматография гель-фильтрацией – имеет второе название «метод молекулярных сит». В качестве сит используют сефадекс (полисахарид декстран, обработанный эпихлоридгидрином). Зерна сефадекса набухают в воде и образуют гель. Набухшие гранулы имеют поры определенного диаметра.

Разделение основано на том, что зерна сефадекса (поры гранул) непроницаемы или ограничено проницаемы для веществ с большой молекулярной массой, а небольшие молекулы свободно диффундируют (проникают) в поры зерен.

Гелеобразную массу набухшего сефадекса помещают в стеклянную колонку (трубку), на поверхности геля наносят слой белкового раствора (рис. 12, а) и затем через колонку пропускают буферный раствор (элюирующая жидкость). Белки проходят вдоль колонки между гранулами тем медленнее, чем меньше их молекулярная масса, так как молекулы белков с еще меньшей молекулярной массой легче диффундируют внутрь гранул (в поры) (рис. 12).

Рис. 12. Фракционирование белков методом гель-фильтрации

Белки вымываются (элюируются) из колонки в порядке убывания молекулярной массы. Следовательно, первыми элюируются крупные белковые молекулы (рис. 12, б), которые не диффундируют в зерна, затем мелкие молекулы и в последнюю очередь низкомолекулярные примеси.

Этот метод применяют не только для фракционирования белков по молекулярной массе, но и для очистки их от низкомолекулярных примесей.

– аффинная хроматография – или хроматография по сродству. Принцип метода заключается в том, что происходит избирательное взаимодействие белков со специфическими веществами – лигандами, закрепленными на носителях (рис. 13).

В качестве носителя используют активированную бромцианом сефарозу. К сефарозе присоединяют лиганды различного происхождения – субстрат, или антиген, или рецептор, которые будут афинно связывать только один белок из смеси:

– субстрат → фермент;

– антиген → антитело;

– гормон → рецептор данного гормона.

Другие белки, не связавшиеся с лигандом, удаляются путем промывания колонки.

Рис. 13. Механизм аффинной хроматографии

Снятие с колонки афинно закрепленного белка осуществляется с помощью буферного раствора (элюента). В состав буфера вводят детергент, который ослабляет связи между белком и лигандом, или через колонку пропускают раствор с высокой концентрацией свободного лиганда. В этом случае белок легче связывается со свободным лигандом и вымывается (элюируется) из колонки.

На каких физико-химических особенностях белков могут быть основаны способы их разделения? Во-первых, это размер молекулы, ее геометрия. На использовании этой особенности базируются методы гель-хроматографии и ультрафильтрации, отчасти электрофорез в гелях.

Во-вторых, характерное для данного белка распределение заряженных групп на его поверхности. Соотношение катионных и анионных групп в белке меняется в зависимости от рН, изоэлектрические точки белков -- pI (значения рН, при котором положительные и отрицательные заряды белка полностью компенсированы и суммарный заряд равен нулю) существенно различаются у разных белков. Известны белки, являющиеся в физиологических условиях катионными, анионными или молекулами без заметного преобладания того или иного заряда. На различии заряда белков при разных рН основано их разделение методами электрофореза, изоэлектрического фокусирования, изоэлектрической и ионообменной хроматографии. Существенно, однако, не только соотношение заряженных групп, определяющее значение pI. Белки со сходными изоэлектрическими точками могут различаться распределением заряженных функциональных групп по поверхности глобулы. Последние размещаются более или менее равномерно либо; наоборот, образуют локальные сгущения, гроздья одинаково заряженных групп, что сказывается при ионнообменной хроматографии белка.

В-третьих, белки различаются числом и характером гидрофобных участков поверхности, что используют при гидрофобной хроматографии

Заметим, что ни один из рассмотренных выше признаков не может сам по себе обеспечить выделение индивидуального белка из сложной смеси -- они недостаточно характеристичны, не гарантируют избирательности очистки. Значительно более перспективно в этом отношении

использование для выделения функциональных свойств белка. Действительно, среди множества белков в исходном материале найдется немало таких, которые имеют сходную молекулярную массу или близкие изоэлектрические точки, однако число, например, фосфатаз или амилаз будет заведомо небольшим. Очевидно, что метод выделения, основанный на использовании способности этих ферментов взаимодействовать со своим специфическим субстратом, несравненно избирательнее, чем любой прием, базирующийся на разнице физико-химических свойств.

Схемы выделения белков, использующие только один какой-либо принцип, редки, обычно различные подходы к фракционированию сочетаются и дополняют друг друга.

Разделение белков по молекулярной массе. Гель-хроматография (гель-фильтрация)

В этом методе используют гранулированные гели поперечно-сшитых гидрофильных материалов, например декстрана (сефадекс, сефароза и их аналоги), полиакриламида (биогели и их аналоги), поливинилового спирта (тойоперл). Гранулы образованы трехмерной сеткой полимера, которая непроницаема для крупных молекул, частично проницаема для молекул промежуточного размера и хорошо проницаема для небольших молекул, солей и воды. В зависимости от среднего размера ячейки полимерного геля и геометрии молекулы последней доступна большая или меньшая часть общего объема гранул геля.

При движении раствора, содержащего белки и другие молекулы, по колонке, которая заполнена набухшими гранулами геля, компоненты смеси, проникшие в гель, задерживаются в нем. Таким образом, они отстают от более крупных молекул, которые не могут войти внутрь гранул и находятся только в омывающем их растворе. Не будучи включенными в гель, крупные молекулы появляются в элюате, как только через колонку пройдет "свободный" объем раствора, равный объему раствора, заключенному между гранулами геля. Последний определяется плотностью упаковки и геометрией гранул. Для сферических частиц, в виде которых обычно и выпускаются материалы для гель-хроматографии, свободный объем составляет 30--35% общего объема колонки.

Если размеры молекул белка таковы, что они могут проникать в поры, составляющие некоторую часть объема гранул, то будет наблюдаться задержка элюции и белок появится в объеме V e , связанном с коэффициентом доступности (долей объема гранул, доступной данному виду молекул) соотношением:

где V, -- полный объем колонки, за вычетом той его части, которая приходится на сам гель образующий полимер.

Каждому белку в зависимости от размеров его молекулы соответствует свое значение, на чем и основало разделение при гель-хроматографии. Понятно, что если объем элюции близок к свободному объему, то стремится к нулю и разделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не произойдет. Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаем весь объем геля (V e близок к и стремится к единице), в геле с данными характеристиками не разделятся. Наилучшее разрешение получается, если находится в пределах 0,4 -- 0,6. Разумеется, пределы разделения можно расширить, используя для высокомолекулярных белков крупнопористые, а для небольших -- мелкопористые гели.

Строго говоря, при гель-хроматографии разделение белков определяется не молекулярной массой, а геометрическими размерами молекулы. Соответственно, молекулы вытянутой формы за счет "кувыркания" в растворе труднее проникают в гели, чем сферические молекулы такой же молекулярной массы. Этим объясняется ранняя элюция денатурированных белков, которые ведут себя как неупорядоченный рыхлый клубок, а не как компактная глобула.

Простая зависимость между объемом элюции и молекулярной массой белка (справедливая, конечно, только для компактных сферических молекул) и легкость эксперимента сделали гель-хроматографию излюбленным методом определения молекулярной массы белков. Для этой цели колонку, заполненную соответствующим гелем, калибруют набором белков с известными молекулярными массами, после чего определяют объем элюции изучаемого белка и вычисляют его молекулярную массу интерполяцией. Точность метода не очень велика, но вполне достаточна для большинства практически встречающихся задач.

При использовании данного метода необходимо учитывать ограничения, возникающие из-за того, что гель, образующий материал не вполне инертен, как это предполагает теория метода, и может взаимодействовать с разделяемыми веществами, что искажает зависимость объема элюции от размера молекулы. Это особенно сказывается при разделении малых количеств белка, так как сорбционная емкость матрицы геля невелика и в крупномасштабных опытах ее взаимодействие с белком мало отражается на процессе.

Связывание белков гельобразующими материалами может быть вызвано ионообменными взаимодействиями, в частности содержанием отрицательно заряженных групп в полисахаридных матрицах (сефароза, сефадекс), а также в полиакриламидных материалах. В последних карбоксильные группы возникают при спонтанном гидролизе амидов, в полисахаридах же они могут образовываться в результате окисления. Задержка при гель-хроматографии, вызванная ионообменными взаимодействиями с матрицей, особенно характерна для катионных белков, например лизоцима и некоторых субтилизинов. Нередко она весьма значительна и может даже препятствовать отделению солей от белка. В аналитических опытах такое удерживание удается подавить значительным повышением ионной силы раствора.

Еще одна причина аномального удерживания веществ при гель-хроматографии, особенно заметная при выделении небольших молекул, например пептидов. -- гидрофобное связывание с матрицей геля.

Гидрофобные элементы включаются в гидрофильные полисахаридные матрицы при обработке их сшивающими агентами, в частности эпи-хлоргидрином, при синтезе сефадекса. Пептиды, содержащие гидрофобные, в особенности ароматические, остатки (фенилалаиина, триптофана) иногда удерживаются матрицей столь значительно, что появляются в элюате позже неорганических солей.

Разрешающая способность метода не очень велика, в то же время простота проведения и мягкость условий эксперимента являются его бесспорными преимуществами. Применимость метода на первых этапах очистки ограничивается тем, что для удовлетворительного фракционирования белков объем наносимого раствора не должен превышать

3-5% общего объема колонки. Ввиду этого к гель-хроматографии обычно прибегают в середине или на завершающих этапах выделения белка. Разумеется, при отделении низкомолекулярных примесей, в частности при обессоливании, объем образца может быть значительно большим, поскольку не требуется высокого разрешения. В таком упрощенном варианте гель-фильтрацию используют особенно часто.

Несмотря на указанные ограничения, гель-хроматография -- удобный способ фракционирования белков. Его применяют и для отделения от белков низкомолекулярных примесей, в том числе солей.

В последнее время наряду с гельобразующими материалами для разделения белков по размерам начали применять макропористые неорганические носители -- макропористые стекло и силикагель. Обычно поверхность этих материалов покрывают гидрофильными органическими веществами, чтобы исключить необратимую сорбцию белков. Жесткость этих материалов позволяет разделять белки по размеру молекул при повышенных давлениях, что ускоряет процесс и снижает помехи со стороны диффузии.