ENZIMATIKUS REAKCIÓKINETIKÁK
tanulmányozza az enzimatikus p-ionok időbeni áramlási mintázatait, valamint azok mechanizmusát; fejezet kémiai kinetika.
katalitikus az in-va S (szubsztrát) P termékké való átalakulási ciklusa az E enzim hatására egy intermedier képződésével megy végbe. konn. x én:
ahol ki- az egyes elemi fokozatok sebességi állandói,
enzim-szubsztrát komplex képződése X 1 (ES, Michaelis komplex).
Adott t-re mellett a p-ció sebessége az enzim, a szubsztrát koncentrációjától és a táptalaj összetételétől függ. Az enzimatikus p-ionok stacionárius, prestacionárius és relaxációs kinetikája létezik.
Stacionárius kinetika.Álló állapotban a közbenső komm. (dX én/dt= 0, i = 1, ..., n) és szubsztrát felesleggel, ahol [S] 0 és [E] 0 a kezdeti koncentráció. szubsztrát és enzim, a folyamat kinetikáját a közöttük lévő állandó, időben invariáns koncentrációszint jellemzi. comp., és a folyamat sebességének kifejezése v 0, hívott kezdeti állósebesség, a következő formában van (Michaelis-Menten egyenlet):
(1)
ahol az értékek k cat és K m -> az elemi fokozatok sebességi állandóinak függvényei, és az egyenletek adják meg:
A k értéke kat
hívott hatékony katalizátor. folyamat sebesség állandó, paraméter K m -> Michaelis állandó. A k értéke kat
mennyiségek határozzák meg max. lassú szakaszok katalitikus. kerületek és néha hívják. az enzim fordulatszáma (enzimrendszer); k kat
a katalizátorok számát jellemzi. az enzimrendszer által időegység alatt végrehajtott ciklusok. Naib. gyakori, melynek értéke k kat. konkrét. hordozók a 10 2 -10 3 s -1 tartományban. A Michaelis-állandó tipikus értékei a 10 -3 - 10 -4 M tartományban vannak.
A szubsztrát magas koncentrációinál, vagyis a p-tion sebessége nem függ a szubsztrát koncentrációjától, és elér egy állandó értéket, ún. Max. sebesség. Grafikailag a Michaelis-Menten egyenlet egy hiperbola. Linearizálható a kettős reciprok módszerével (a Lineweaver-Burk módszer), azaz az 1/v 1/[S] 0-ra való függőségének felépítésével, vagy más módszerekkel. Az (1) egyenlet lineáris alakja a következő:
(2)
Lehetővé teszi az értékek grafikus meghatározását K més v max (1. ábra).
Rizs. 1. A Michaelis - Menten egyenlet lineáris transzformációjának grafikonja kettős reciprokban (Lineweaver - Burke szerint).
Érték K m > számszerűen megegyezik a szubsztrát koncentrációjával, amelynél a p-ció sebessége egyenlő, ezért K m gyakran a szubsztrát és az enzim affinitásának mértékeként szolgál, de ez csak akkor igaz, ha
Mennyiségek K m >és a pH-értékek függvényében változnak. Ez annak köszönhető, hogy a katalízisben részt vevő enzimmolekula csoportjai képesek megváltoztatni ionizációs állapotukat és ezáltal katalitikusukat. hatékonyság. A pH változása a legegyszerűbb esetben a katalízisben részt vevő enzim legalább két ionizálható csoportjának protonálódásához vagy deprotonálásához vezet. Ha ebben az esetben az enzim-szubsztrát komplexnek csak egy formája (például ESH) a három lehetséges formából (ES, ESH és ESH 2) képes oldattermékké alakulni, akkor a sebesség pH-tól való függését írjuk le. az f-loy által:
ahol f= 1 + / és f" = 1 +
+K" b/>-t. hívott Michaelis pH-függvényei, és K a, K bés K" a, K" b -> csoport ionizációs állandó a és b. ingyenes enzim és enzim-szubsztrát komplex. lg koordinátákkal - pH ezt a függést a 3. ábra mutatja. 2, és a görbe emelkedő, pH-független és csökkenő ágai érintőinek meredekségei +1, 0, illetve -1 legyenek. Egy ilyen grafikonból meg lehet határozni az értékeket RK a katalízisben részt vevő csoportok.
Rizs. 2. A katalizátor függősége állandók pH-tól logaritmikusig. koordináták.
Az enzimatikus p-ció sebessége nem mindig függ az (1) egyenlettől. Az egyik leggyakoribb eset - részvétel a kerületben alloszterikus. enzimek (lásd enzimszabályozók) to-rykh esetében az enzim telítési fokának [S] 0-tól való függése nem hiperbolikus. karakter (3. ábra). Ez a jelenség a szubsztrátkötés kooperativitásának köszönhető, vagyis amikor egy szubsztrát kötődése az enzim makromolekula egyik helyéhez megnöveli (pozitív kooperativitás) vagy csökkenti (negatív kooperativitás) affinitást egy másik hely szubsztrátjához.
Rizs. H Az enzim szubsztráttal való telítési fokának függősége a pozitív (I) és negatív (II) kooperativitású szubsztrát koncentrációjától, valamint annak hiányában (III).
Prestacionárius kinetika. Az enzim és szubsztrát oldatok gyors, 10 -6 -10 -1 s időintervallumban történő keveredésével átmeneti folyamatok figyelhetők meg, amelyek megelőzik a stabil stacionárius állapot kialakulását. Ebben a prestacionárius üzemmódban, ha nagy mennyiségű hordozót használunk, a differenciálrendszer. A folyamatok kinetikáját leíró ur-ció lineáris. Megoldás ebből a típusból lineáris differenciálművek rendszerei. Az ur-ciót az exponenciális tagok összege adja. Szóval a kinetika miatt A fent bemutatott séma szerint a termék felhalmozódásának kinetikája a következő:
hol egy én ->, b és n -> elemi sebességi állandók függvényei; -a megfelelő jellemző gyökerei. ur-ció.
A reciprok , ún. jellegzetes feldolgozási idő:
A p-cióhoz nintermedier részvételével áramló. Comm., kaphat nkarakterisztikát. alkalommal.
Az enzimatikus körzet kinetikájának tanulmányozása prestacionárius módban lehetővé teszi, hogy képet kapjon a katalitikus mechanizmus részletes mechanizmusáról. ciklust, és határozza meg a folyamat elemi szakaszainak sebességi állandóit.
Kísérletileg az enzimes oldat kinetikáját prestacionárius módban a stop jet módszerrel tanulmányozzuk (lásd 1. sugárkinetikai módszerek), lehetővé téve a kerület összetevőinek 1 ms-on belüli összekeverését.
Relaxációs kinetika. A rendszerre gyakorolt gyors perturbáló hatás (t-ry, nyomás, elektromos mezők változása) mellett a katalizátort meghatározó folyamatok sebességétől függ, hogy a rendszer mennyi idő alatt ér el új egyensúlyi vagy stacionárius állapotot. enzimatikus ciklus.
A folyamat kinetikáját leíró egyenletrendszer lineáris, ha az egyensúlyi helyzetből való elmozdulás kicsi. A rendszer megoldása a komponensek koncentrációinak függőségéhez vezet dekomplikálni. a folyamat szakaszai exponenciális tagok összege formájában, amelyek exponensei relaxációs idők jellegűek. A vizsgálat eredménye az intervallumok számának megfelelő relaxációs idők spektruma. A folyamatban részt vevő komm. A relaxációs idők a folyamatok elemi szakaszainak sebességi állandóitól függenek.
Relaxációs módszerek a kinetika lehetővé teszi az intermedierek átalakulásának egyes elemi szakaszai sebességi állandóinak meghatározását. A relaxációs kinetika tanulmányozásának módszerei eltérőek. felbontás: ultrahang abszorpció - 10 -6 -10 -10
s, hőmérséklet ugrás - 1O -4 -10 -6 s, elektromos módszer. impulzus - 10 -4 -10 -6 s, nyomásugrás - 10 -2 s. Az enzimatikus p-ionok kinetikájának vizsgálatában a hőmérsékletugrás módszerével találták meg az alkalmazást.
Enzimatikus folyamatok makrokinetikája. Eljárások kidolgozása heterogén katalizátorok előállítására enzimek immobilizálásával bomlás közben. média (lásd Immobilizált enzimek) szükségessé tette a folyamatok kinetikájának elemzését, figyelembe véve a szubsztrát tömegátadását. A p-ionok kinetikájának törvényszerűségeit elméletileg és kísérletileg vizsgáltuk, figyelembe véve a diffúziós réteg hatását, valamint olyan rendszerek esetében, amelyek intradiffúziós nehézségekkel küzdenek az enzim hordozón belüli eloszlásában.
Olyan körülmények között, ahol a folyamat kinetikáját befolyásolja a szubsztrát diffúziós átvitele, katalitikus. csökken a rendszer hatékonysága. A hatékonysági tényező megegyezik a diffúziós-csökkentett szubsztrátkoncentrációjú enzimes körzet áramlási körülményei között a termék áramlási sűrűségének az áramláshoz viszonyított arányával, amely diffúziós korlátozások hiányában megvalósítható. A tisztán diffúziós tartományban, amikor a folyamat sebességét a szubsztrát tömegátadása határozza meg, a külső diffúziógátlásos rendszerek hatékonysági tényezője fordítottan arányos a diffúziós modulussal:
ahol
diffúziós rétegvastagság, D - együttható. szubsztrát diffúzió.
Intradiffúziós lassítású rendszerekhez elsőrendű p-ionokban
ahol f t- dimenzió nélküli modul (Thiele modul).
A kinetika elemzésekor törvényszerűségek a fermentációs reaktorokban széles elméleti. és kísérletezzen. Kidolgozták a reaktorok "ideális" modelljeit, az áramlásos reaktort (ideális keveredésű áramlási reaktort), az ideális kiszorítású áramlásos reaktort és a membránreaktort.
Polienzimatikus folyamatok kinetikája. A szervezetben (sejtben) az enzimek nem elszigetelten fejtik ki hatásukat, hanem a molekulák átalakulási láncait katalizálják. R-ció polienzimatikus rendszerekben kinetikával. nézőpontjai következetesnek tekinthetők. folyamatok, specifikus a to-rykh jellemzője az egyes szakaszok enzimei:
ahol ,
ill. max, folyamat sebessége és Michaelis állandó én kerületi szakaszának, ill.
Fontos tulajdonság folyamat - a stabil álló állapot kialakulásának lehetősége. Előfordulásának feltétele az egyenlőtlenség lehet > v 0, ahol v 0 a korlátozó fokozat sebessége, amelyet a legkisebb sebességi állandó jellemez, és így meghatározza a teljes sorozat sebességét. folyamat. Stacionárius állapotban a metabolitok koncentrációja a limitáló szakasz után kisebb, mint a megfelelő enzim Michaelis-állandója.
Különleges a polienzimatikus rendszerek egy csoportját az oxidáló.-visszaállítást végző rendszerek alkotják. p-tion fehérje elektronhordozók részvételével. A hordozók formája specifikus. szerkezetek, komplexek determinisztikus elektronátviteli sorozattal. Kinetikus az ilyen rendszerek leírása a decomp áramkörök független állapotváltozójának tekinthető. az elektronok populációjának mértéke.
Alkalmazás. F. r. széles körben használják a kutatási gyakorlatban az enzimek és enzimrendszerek hatásmechanizmusainak tanulmányozására. Az enzimtudomány gyakorlatilag jelentős területe mérnöki enzimológia, F. r fogalmaival operál. a biotechnológia optimalizálásához. folyamatokat.
Megvilágított.: Poltorak O. M., Chukhrai E. S., Physical and Chemical Bases of Enzymatic catalysis, M., 1971; Berezin IV, Martinek K, Az enzimatikus katalízis fizikai kémiájának alapjai, M., 1977; Varfolomeev S. D., Zaitsev S. V., Kinetikai módszerek in biokémiai kutatás, M.. 1982. S. D. Varfolomeev.
Kémiai enciklopédia. - M.: Szovjet enciklopédia. Szerk. I. L. Knunyants. 1988 .
Nézze meg, mi az "ENZIMATÍV REAKCIÓKINETICS" más szótárakban:
katalitikus rtion ciklikus. számos elemi arányból álló folyamat, amelyek sebességét a ható tömegtörvény írja le. Ennek a törvénynek egyszerű formája van az ideális gázelegyekre, ideális p-árokra és ideális felületi rétegekre. Kémiai Enciklopédia
A kémiai reakciók kinetikája, a kémiai folyamatok tana, lefolyásuk törvényszerűségei időben, sebességben és mechanizmusban. A modern kémia és kémia legfontosabb területei ... ... a kémiai reakciók kinetikájának vizsgálatához kapcsolódnak. Nagy szovjet enciklopédia
KINETIKA VEGYI- (a görög. kinesis mozgalomból), az elméleti kémia tanszéke, amely a kémia törvényeinek tanulmányozásával foglalkozik. reakciók. Többféle kémia létezik. kölcsönhatások, és mindenekelőtt a homogén (homogén) közegben végbemenő reakciók megkülönböztetése azoktól a reakcióktól, amelyek ... ... Nagy orvosi enciklopédia
- (biokatalízis), a biokémiai gyorsítás. fehérje makromolekulák, úgynevezett enzimek (enzimek) részvételével. F. to. egyfajta katalízis, bár az erjedés (fermentáció) kifejezést ősidők óta ismerték, amikor még nem volt kémiai fogalom. katalízis. Első… … Kémiai Enciklopédia
- (a latin re előtagból, ami fordított hatást és actio cselekvést jelent), egyesek in-ben (kezdeti vegyületek) átalakulása másokká (a reakció termékeivé) az atommagok változatlanságával (ellentétben a magreakciókkal). Kezdeti kapcsolatok R. x. néha úgy hívják...... Kémiai Enciklopédia
- (lat. fermentum kovászból) (enzimek), fehérjék, amelyek katalizátorként működnek az élő szervezetekben. Fő F. funkciói a szervezetbe való átalakulás felgyorsítása, a szervezetbe jutás és az anyagcsere során képződő (sejtszerkezetek megújítása, annak biztosítása ... Kémiai Enciklopédia
- (a görög pharmakon medicina és kinetikos szóból mozgásba hoz), kinetikát tanul. lekkel előforduló folyamatok mintázatai. cfd a testben. Fő farmakokinetikai. folyamatok: felszívódás, eloszlás, anyagcsere és kiválasztódás (kiválasztás). Kémiai Enciklopédia
Az enzimológia ezen része különböző tényezők hatását vizsgálja az enzimatikus reakció sebességére. Figyelembe véve az egyik szubsztrát egyetlen termékké történő átalakulásának reverzibilis reakciójának enzimatikus katalízisének általános egyenletét (1),
az enzimreakció sebességét befolyásoló fő tényezőket meg kell nevezni: szubsztrátkoncentráció [S], enzimkoncentráció [E] és reakciótermék-koncentráció [P].
Egyes enzimek és szubsztrátjuk kölcsönhatása az V enzimreakció sebességének a szubsztrát koncentrációjától való függésének hiperbolikus görbéjével írható le [S] (19. ábra):
19. ábra Az enzimreakció sebességének függése a szubsztrát koncentrációjától.
Ezen a görbén három szegmens különíthető el, ami az enzim és a szubsztrát kölcsönhatási mechanizmusának helyzetével magyarázható: OA a V egyenesen arányos függésének szegmense [S]-től, az enzim aktív helyeitől. fokozatosan megtelnek szubsztrát molekulákkal, instabil komplex ES képződésével; AB szakasz - V görbe vonalú függése [S]-től, az enzim aktív centrumainak teljes telítettsége szubsztrát molekulákkal még nem sikerült. Komplex ES elérése előtt átmeneti állapot instabil, az E és S felé fordított disszociáció valószínűsége még mindig magas; BC szegmens - a függőséget nulladrendű egyenlet írja le, a szakasz párhuzamos az [S] tengellyel, teljes telítettség érhető el aktív enzimek szubsztrát molekulák, V=V max.
A görbe karakterisztikus alakját a Briggs-Haldane egyenlet írja le matematikailag:
V=V max ● [S]/Km + [S] (2),
ahol Km a Michaelis-Menten állandó, számszerűen egyenlő azzal a szubsztrát-koncentrációval, amelynél az enzimreakció sebessége egyenlő V max felével.
Minél kisebb az enzim K m értéke, annál nagyobb az enzim affinitása a szubsztráthoz, annál gyorsabban éri el a szubsztrát átmeneti állapotát, és az átalakul reakciótermékké. Az egyes csoportspecifikus enzimszubsztrátok Km-értékeinek megtalálása fontos a meghatározásához biológiai szerepe ez az enzim a sejtben.
A legtöbb enzim esetében lehetetlen hiperbolikus görbét megszerkeszteni (19. ábra) Ebben az esetben a kettős reciprok módszert (Lineweaver-Burk) alkalmazzuk, ti. 1/[V] grafikus függése 1/[S]-től ábrázolódik (20. ábra). Az ilyen görbék kísérletben történő felépítésének módszere nagyon kényelmes, ha különböző típusú inhibitorok hatását vizsgáljuk az enzimek aktivitására (lásd az alábbi szöveget).
20. ábra. 1/[V] és 1/[S] görbe (Lineweaver-Burk módszer),
ahol y-levágási terület - , és x - vágási terület - 
, az α - szög érintője.
Az enzimatikus reakciósebesség V függése az enzimkoncentrációtól [E].
Ezt a grafikus függést (21. ábra) optimális hőmérsékleten és pH-n vesszük figyelembe környezet, az enzim aktív helyeinek telítési koncentrációját jelentősen meghaladó szubsztrátkoncentrációnál.
Rizs. 21. Az enzimkoncentráció hatása az enzimatikus reakció sebességére.
Az enzimatikus reakciósebesség függése a kofaktor vagy koenzim koncentrációjától. Komplex enzimek esetében szem előtt kell tartani, hogy a vitaminok koenzim formáinak hiánya hipovitaminózisban, a fémionok szervezetbe történő felvételének megsértése szükségszerűen az anyagcsere folyamatához szükséges megfelelő enzimek koncentrációjának csökkenéséhez vezet. folyamatokat. Ezért azt a következtetést kell levonni, hogy az enzim aktivitása közvetlenül függ a kofaktor vagy koenzim koncentrációjától.
A termékek koncentrációjának hatása az enzimreakció sebességére. Az emberi szervezetben fellépő reverzibilis reakcióknál figyelembe kell venni, hogy a közvetlen reakció termékeit az enzim a fordított reakció szubsztrátjaként tudja felhasználni. Ezért az áramlás iránya és a V max elérésének pillanata a kiindulási szubsztrátok és reakciótermékek koncentrációinak arányától függ. Például az alanin aminotranszferáz aktivitása, amely katalizálja az átalakulást:
Alanin + Alfa-ketoglutarát ↔ Piruvát + Glutamát
a sejtben a koncentrációk arányától függ:
[alanin + alfa-ketoglutarát] / [piruvát + glutamát].
AZ ENZIM HATÁSMECHANIZMUS. AZ ENZIMATÍV KATALIZIS ELMÉLETEI
Az enzimek, mint a nem fehérje katalizátorok, növelik a sebességet kémiai reakció ennek a reakciónak az aktiválási energiáját csökkentő képessége miatt. Az enzimreakció aktiválási energiáját a folyamatban lévő reakció rendszerében az átmeneti állapotot elérő energiaérték és a reakció elején meghatározott energia közötti különbségként számítjuk ki (lásd a grafikus függést a 22. ábrán).
Rizs. 22. Enzim nélkül (1) és enzim jelenlétében (2) lezajló kémiai reakció energiaállapotának grafikus függése a reakció időpontjától.
V. Henry és különösen L. Michaelis, M. Menten monoszubsztrát reverzibilis enzimreakciók mechanizmusának tanulmányozásával foglalkozó munkái lehetővé tették annak feltételezését, hogy az E enzim először reverzibilisen és viszonylag gyorsan egyesül S szubsztrátjával, és képződik. enzim-szubsztrát komplex (ES):
E+S<=>ES (1)
Az ES kialakulása hidrogénkötések, elektrosztatikus, hidrofób kölcsönhatások, esetenként kovalens, koordinációs kötések következtében jön létre az aktív centrum aminosav-maradékainak oldalgyökei és a szubsztrát funkciós csoportjai között. A komplex enzimekben a szerkezet nem fehérje része is elláthatja a szubsztráttal való érintkezés funkcióját.
Az enzim-szubsztrát komplex ezután egy második, lassabb, reverzibilis reakcióban bomlik le, így keletkezik a P reakciótermék és a szabad E enzim:
ES<=>EP<=>E + P (2)
Jelenleg a fent említett tudósok, valamint Kaylin D., Chance B., Koshland D. (az "indukált konformitás elmélete") munkájának köszönhetően a mechanizmus négy fő pontjára vonatkozóan vannak elméleti rendelkezések. enzimhatás a szubsztrátumon, amelyek meghatározzák az enzimek azon képességét, hogy felgyorsítsák a kémiai reakciókat.
1. Tájékozódás és közelség . Az enzim úgy képes megkötni a szubsztrát molekulát, hogy az enzim által megtámadt kötés ne csak a katalitikus csoport közvetlen közelében helyezkedjen el, hanem ahhoz képest helyesen is orientálódjon. Nagymértékben megnő annak a valószínűsége, hogy az ES komplex az orientáció és a megközelítés miatt eléri az átmeneti állapotot.
2. Stressz és feszültség : indukált illeszkedés. A szubsztrát kötődése konformációs változásokat idézhet elő az enzimmolekulában, ami feszültséghez vezet az aktív hely szerkezetében, valamint némileg deformálja a megkötött szubsztrátot, ezáltal elősegíti az ES komplex általi átmeneti állapot elérését. Az E és S molekulák között úgynevezett indukált megfelelés van.
DE). Az enzimatikus reakciósebesség függése az enzimek számától
Ha enzimes reakciót hajtunk végre szubsztrátfelesleg körülményei között, a reakció sebessége az enzim koncentrációjától függ. Egy ilyen reakció grafikus függősége egyenes vonalú, azonban az enzim mennyiségét gyakran lehetetlen abszolút értékben meghatározni, ezért a gyakorlatban az enzim aktivitását jellemző feltételes értékeket alkalmazzák: egy A nemzetközi aktivitási egység (IU) annak az enzimmennyiségnek felel meg, amely az enzimreakcióhoz optimális körülmények között 1 μmol szubsztrát átalakulását 1 percenként katalizálja. Az optimális körülmények minden enzim esetében egyediek, és a tápközeg hőmérsékletétől, az oldat pH-jától függenek aktivátorok és inhibitorok hiányában.
A termék (A) felhalmozódásának és a (B) szubsztrát veszteségének függése a reakció idejétől (időtartamától). Az enzimreakció sebességét a termék vagy szubsztrát koncentrációjának időegységenkénti változása határozza meg. Az 1-es és 2-es enzim által katalizált reakciókban az 1-es enzim által katalizált reakció kezdeti sebessége kisebb, mint a 2-es enzim által katalizált reakció sebessége, mivel a reakcióprofil görbe érintőjének meredekségének tangense a A második enzim "O" pontja magasabb, mint a termék (A) felhalmozódása és a szubsztrát elvesztése (B) esetén. A sebességet bármely t időpontban a reakcióprofil érintőjének meredeksége határozza meg a t időpontban. Az enzimes reakció időtartamát a termék lineáris felhalmozódása (vagy a szubsztrát elvesztése) jellemzi a reakció időtartamától függően. Az enzimreakció időtartamát a termék nemlineáris felhalmozódása (vagy a szubsztrát elvesztése) jellemzi a reakcióidőtől függően.
Az nME aktivitási egységek számát a következő képlet határozza meg:
B). Az enzimatikus reakciósebesség függése a közeg hőmérsékletétől
A hőmérséklet bizonyos határokig történő emelése befolyásolja az enzimatikus sebességet
A reakciók hasonlóak a hőmérséklet bármely kémiai reakcióra gyakorolt hatásához. A hőmérséklet emelkedésével a molekulák mozgása felgyorsul, ami a reagáló anyagok kölcsönhatásának valószínűségének növekedéséhez vezet. Ezenkívül a hőmérséklet növelheti a reagáló molekulák energiáját, ami szintén felgyorsítja a reakciót. Az enzimek által katalizált kémiai reakció sebességének azonban megvan a maga hőmérsékleti optimuma, melynek feleslegéhez a fehérjemolekula termikus denaturációja miatti enzimaktivitás csökkenése társul.
A legtöbb emberi enzim esetében az optimális hőmérséklet 37-38 °C. Azonban a természetben is léteznek hőstabil enzimek. Például a meleg forrásokban élő mikroorganizmusokból izolált Taq polimeráz nem inaktiválódik, ha a hőmérséklet 95 °C-ra emelkedik. Ezt az enzimet a tudományos és gyakorlati gyógyászatban használják betegségek molekuláris diagnosztikájára polimeráz láncreakció (PCR) módszerrel.
NÁL NÉL). Az enzimatikus reakciósebesség függése a szubsztrát mennyiségétől
A szubsztrátum mennyiségének növekedésével a kezdeti sebesség növekszik. Amikor az enzim teljesen telítődik a szubsztráttal, pl. az enzim-szubsztrát komplex kialakulása az enzim adott koncentrációja mellett a lehető legnagyobb, a termékképződés legnagyobb sebessége figyelhető meg. A szubsztrát koncentrációjának további növelése nem vezet a termék képződésének növekedéséhez; a reakciósebesség nem növekszik. Ez az állapot megfelel a Vmax maximális reakciósebességnek.
Így az enzim koncentrációja a korlátozó tényező a termék képződésében. Ez a megfigyelés képezte az L. Michaelis és M. Menten tudósok által 1913-ban kidolgozott enzimatikus kinetika alapját.
A reakció sebessége arányos az ES enzim-szubsztrát komplex koncentrációjával, az ES képződés sebessége pedig a szubsztrát koncentrációjától és a szabad enzim koncentrációjától függ. Az ES koncentrációját befolyásolja az ES képződésének és bomlásának sebessége.
A legnagyobb reakciósebesség akkor figyelhető meg, ha az összes enzimmolekula komplexben van a szubsztráttal, pl. az ES enzim-szubsztrát komplexben, azaz. [E] = .
Az enzimreakció sebességének a szubsztrát koncentrációjától való függését a következő egyenlet fejezi ki (enzimkinetikai tankönyvekben ennek a képletnek a matematikai származtatása található):
V = Vmax [S] / Km + [S]
Ezt az egyenletet Michaelis-Menten egyenletnek nevezik.
A Michaelis-Menten egyenlet az enzimatikus kinetika alapegyenlete, amely leírja az enzimatikus reakció sebességének a szubsztrát koncentrációjától való függését.
Ha a szubsztrátum koncentrációja jóval nagyobb, mint Km (S >> Km), akkor a szubsztrát koncentráció Km értékkel történő növelése gyakorlatilag nincs hatással az összegre (Km + S) és egyenlőnek tekinthető a szubsztrát koncentrációval. . Következésképpen a reakciósebesség egyenlő lesz a maximális sebességgel: V = Vmax. Ilyen körülmények között a reakció nulla rendű, azaz. nem függ az aljzat koncentrációjától. Megállapítható, hogy a Vmax egy adott enzimkoncentrációhoz tartozó állandó érték, amely független a szubsztrátkoncentrációtól.
Ha a szubsztrát koncentrációja lényegesen kisebb, mint Km(S<< Km), то сумма (Km + S) примерно равна Кm, следовательно, V = Vmax[S]/Km, т.е. в данном случае скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата (реакция имеет первый порядок).
Vmax és Km az enzim hatékonyságának kinetikai jellemzői.
A Vmax az enzim katalitikus aktivitását jellemzi, és az enzimatikus reakciósebesség dimenziója mol/l, azaz. meghatározza a termékképződés maximális lehetőségét adott enzimkoncentráció mellett és szubsztrátfelesleg körülményei között. A Km egy adott enzim affinitását jellemzi egy adott szubsztráthoz, és egy állandó érték, amely nem függ az enzim koncentrációjától. Minél kisebb a Km, annál nagyobb az enzim affinitása egy adott szubsztráthoz, annál nagyobb a kezdeti reakciósebesség, és fordítva, minél nagyobb a Km, minél kisebb a kezdeti reakciósebesség, annál kisebb az enzim affinitása a szubsztráthoz.
Az enzimreakciók sebessége függ a szub-
réteg. Ez a függőség összetett, amit bizonyos enzimek esetében parabolikus görbe ír le (29. ábra).
29. ábra - Az enzimreakció sebességének függése
a szubsztrát koncentrációtól
A függőség parabolikus jellegét az magyarázza, hogy az enzim és a szubsztrát kölcsönhatása enzim-szubsztrát komplex kialakulásához vezet. Kezdetben a szubsztrát koncentrációjának növekedésével a reakcióelegyben az enzim-szubsztrát komplexek koncentrációja nő, ami a reakciósebesség párhuzamos növekedésében nyilvánul meg. A szubsztrát bizonyos koncentrációjában (telítés) a reakcióelegyben lévő enzimmolekulák összes aktív centruma egyfajta "telítettsége" következik be. Az enzimreakció sebessége telítési koncentrációnál maximális lesz. A reakcióelegy szubsztráttartalmának további növelésével ez nem változik.
Az enzimatikus reakciósebesség és a szubsztrátkoncentráció közötti diagramból két fontos mutatót számítunk ki:
1. Maximális reakciósebesség (V max). Ezt a reakciósebességet jelenti telítő szubsztrát koncentrációnál. A maximális sebesség értéke az enzim katalitikus erejét tükrözi. Enzimek, amelyek nagyobbak V max erősebb katalizátorok. Időegység alatt nagyobb számú szubsztrát molekula átalakulását katalizálják. A maximális sebesség értékét az enzim fordulatszáma fejezi ki. A fordulatok számát az enzim által időegység alatt (s -1) átalakított szubsztrátmolekulák száma alapján becsüljük meg. A legtöbb enzim esetében a forgási szám 10 4 tartományba esik. Ugyanakkor vannak olyan enzimek, amelyekre sebesség szignifikánsan több (600 000 a karbanhidráz esetében) vagy kevesebb, mint ez az érték (100 a kimotripszin esetében).
2. Michaelis állandó (Nak nek m). A Michaelis-állandó az a szubsztrátkoncentráció, amelynél a reakciósebesség a maximum fele. Érték Nak nek m az enzim szubsztrát iránti affinitását tükrözi. Minél nagyobb ez az érték, annál kisebb az affinitása a szubsztráthoz az enzimhez. Nak nek m-t a szubsztrát móljaiban fejezzük ki. Igen, az érték Nak nek m a glükózhoz viszonyítva a glükokináz enzim esetében 10 mmol, a hexokináz esetében pedig 0,01 mmol. A hexokináz nagyobb affinitást mutat a glükózhoz, mint a glükokináz; azonos szubsztrátkoncentráció mellett gyorsabban katalizálja a glükóz foszforilációját.
Az enzimatikus reakciósebesség szubsztrát koncentrációtól való függésének matematikai elemzése alapján L. Michaelis és M. Menten (1913) olyan képletet vezettek le, amely lehetővé teszi a reakciósebesség, a maximális sebesség és a Michaelis közötti kapcsolat becslését. állandó. Jelenleg Michaelis-Menten egyenletként definiálják.
V o= V max[ S]/K m + [ S],
ahol V o a reakciósebesség, S a szubsztrát koncentrációja.
Az enzimek általános tulajdonságai
Annak ellenére, hogy bizonyos különbségek vannak szerkezetben, funkcióban és intracelluláris lokalizációban, az enzimeket számos közös tulajdonság jellemzi. Ide tartozik a katalitikus aktivitásuk megnyilvánulása a hőmérséklettől (termikus labilitás) és a táptalaj pH-jától, valamint a szubsztrátspecifitástól.
Az enzimek jellemző tulajdonsága az termolabilitás. Ezt a jelenséget az enzimatikus reakciósebesség reakcióelegy hőmérsékletétől való függésének grafikonjával szemléltethetjük (30. ábra).
30. ábra - Az enzimatikus reakciósebesség függése a hőmérséklettől
reakcióközeg ( t opt az optimális hőmérséklet; V- gyors reakció)
Amint az a bemutatott grafikonból látható, 4 ° C-hoz közeli hőmérsékleten enzimatikus reakciók gyakorlatilag nem fordulnak elő. Emiatt a biológiai tárgyak a biokémiai vizsgálatok előtt bizonyos ideig hidegben tárolhatók. A hideg az, amely lehetővé teszi, hogy megmentse az élelmiszereket az autolízistől (önemésztés).
A hőmérséklet növekedése az enzimatikus reakció sebességének növekedésével jár. Ennek oka a szubsztrát és az enzimmolekulák kinetikus energiájának növekedése, ami hozzájárul a köztük lévő kölcsönhatások sebességének növekedéséhez. Hasonló jelenség figyelhető meg olyan hőmérsékletig, amely megfelel az enzim hőmérsékleti optimumának. Optimális hőmérséklet Enzim megfelel annak a hőmérsékletnek, amelyen az enzimreakció sebessége maximális. A melegvérű állatok enzimjeinél általában 28 o C vagy 37 o C.
A reakcióelegy hőmérsékletének további emelése az enzimes reakció sebességének fokozatos csökkenéséhez vezet. Ez a jelenség a fehérje polipeptid lánc termikus denaturálódási folyamatának köszönhető. A denaturáció az enzim aktív helyének szerkezetének megváltozásával jár, aminek következtében csökken az enzim affinitása a szubsztráthoz. 55 °C feletti hőmérsékleten a legtöbb enzim teljesen elveszíti katalitikus tulajdonságait (inaktiválja). Ebben a tekintetben az 55–56 ° C-ra történő melegítést széles körben használják a pasztőrözési eljáráshoz, ami növeli az élelmiszerek (tej stb.) eltarthatóságát.
A közeg pH-ja nagyban befolyásolja az enzimreakció sebességét. Amint az az ábrán láthatóból látható. 31 grafikonon, alakjában az enzimatikus reakciósebesség hőmérséklettől való függésének grafikonjára hasonlít.
31. ábra - A sebesség függése ( V) enzimatikus reakció
a tápközeg pH-ján (pH opt - az enzim pH-optimuma)
Az enzimatikus reakció sebességének éles csökkenése szélsőséges pH-értékeknél a fehérjemolekula polipeptidláncának savak és lúgok hatására bekövetkező denaturálódásával jár. Az enzim maximális katalitikus teljesítményt mutat pH-n, amelyet a kifejezés határoz meg pH optimum enzim. A legtöbb ismert enzim optimális pH-értéke 5,0 és 7,5 között van. Ugyanakkor számos példa van olyan enzimekre, amelyeknél a pH-optimum a savas vagy lúgos pH-értékek tartományába tolódik el. Ezek az enzimek a következők:
Az enzimreakciók sebességének a pH-tól való függésének oka, hogy a tápközeg pH-értéke kifejezett hatással van a szubsztrát funkciós csoportjainak ionizációs fokára. A borostyánkősav molekula ionizációjának jellemzői a közeg eltérő savasságánál (pH):
Ugyanakkor a közeg pH-ja befolyásolja az enzim aktív központját alkotó aminosavgyökök ionizációs fokát is:
Ha az enzim-szubsztrát komplex képződése az elektrosztatikus kölcsönhatások következtében stabilizálódik, akkor világossá válik a pH szerepe az enzimreakció optimális feltételeinek biztosításában (24. ábra).
Az enzimek által katalizált reakciók sebessége, amelyek szubsztrátokkal való kölcsönhatásában az elektrosztatikus kölcsönhatások nem jelentősek, kisebb mértékben függ a közeg pH-jától. ábrán. A 32. ábra a papain általi fehérjehidrolízis sebességének függőségét mutatja. Ennek az enzimnek a szubsztráttal való kölcsönhatásában a hidrofób kölcsönhatások elsődleges fontosságúak. Amint az a bemutatott grafikonon látható, a papainnak egyáltalán nincs egyértelműen meghatározott pH-optimuma.
32. ábra - A pH hatása a papain általi fehérjehidrolízis sebességére.
Az enzimeknek van egy bizonyos sajátosság szubsztrátumokkal kapcsolatban. A specifitás az enzimek azon tulajdonságára vonatkozik, hogy katalizálják egy vagy hasonló szerkezetű szubsztrátok csoportjának átalakulását. Az enzimspecifitásnak többféle típusa van.
· abszolút specifikum. Egy enzim azon képességére utal, hogy csak egy szubsztrát átalakulását katalizálja. Az abszolút specifitású enzimek közé tartozik az argináz, az urikáz restriktáz stb.
· Relatív specifitás. Arra utal, hogy egy enzim képes katalizálni egy szerkezetben hasonló szubsztrátcsoport átalakulását (az ún. proteolitikus enzimek különböző fehérjéket hidrolizálnak, a glicerin és a magasabb zsírsavak lipáz-észtereit, a hexokináz különféle monoszacharidokat foszforilál). Ebben az esetben a specificitást az határozza meg, hogy az enzim csak egy bizonyos típusú kötésre hat (a proteolitikus enzimek hidrolizálják a peptidkötést, a lipáz hidrolizálja az észterkötést stb.).
· sztereospecifitás . Ez a kifejezés egy enzim azon tulajdonságára utal, hogy katalizálja a szubsztrát egyik sztereoizomerjének átalakulását. Így a monoszacharidok átalakulásában részt vevő enzimek specifikusságot mutatnak azokhoz képest D-sztereoizomerek, és az aminosavak átalakításában részt vevő enzimek - azokká L- sztereo izomerek.
Enzimaktivitás
Az enzimek, mint katalizátorok sajátossága, hogy különböző külső tényezők hatására képesek megváltoztatni katalitikus tulajdonságaikat. Az enzimek katalitikus hatásának erősségének megnyilvánulásának mértéke az enzimek tevékenység. Az enzimek azon képessége, hogy különböző körülmények között megváltoztassák aktivitásukat, nagy biológiai jelentőséggel bír. Ez a tulajdonság lehetővé teszi az élő sejt számára, hogy az anyagcsere-folyamatok állapotát a sejtek pillanatnyi szükségleteihez igazítsa, amelyek különböző külső tényezők hatására jelentősen megváltozhatnak.
Jellemzésükben fontos szerepet játszik az enzimaktivitás meghatározása. Van néhány általános elv az enzimaktivitás kvantitatív meghatározására. Az enzimaktivitás a következőképpen határozható meg:
vagy a reakcióelegyben való felhalmozódás sebességével, ahol a reakciótermék enzimje található;
vagy az enzimatikus reakció szubsztrátjának a reakcióelegyből való eltűnésének sebességével.
Mindkét megközelítés egyenértékű, és a gyakorlatban is használható. Az enzimaktivitás meghatározásakor azonban a következő feltételeket kell betartani: abban a reakcióelegyben, amelyben az enzimaktivitást meghatározzák,
a hőmérsékletnek meg kell felelnie az adott enzim hőmérsékleti optimumának;
A tápközeg pH-jának meg kell felelnie az adott enzim pH-optimumának;
Az aljzat koncentrációja nem lehet kisebb, mint a telítő;
az enzim kofaktorainak jelen kell lenniük, ha vannak ilyenek;
Enzimaktivátoroknak jelen kell lenniük.
Így az enzim aktivitását a számára optimális feltételek mellett határozzák meg. Ilyen körülmények között az enzim aktivitása arányos a vizsgált mintában lévő mennyiségével, ezért felhasználható a koncentráció közvetett becslésére.
Az enzimaktivitást a következőképpen határozzuk meg tevékenységi egységeket. Az enzimaktivitás egy egysége (ED) az enzim azon aktivitása, amely hatására percenként 1 µmol reakciótermék keletkezik (vagy 1 µmol szubsztrát eltűnik). Az SI rendszerben a katal (cat) az enzimaktivitás egysége. 1 katal felel meg az enzim aktivitásának, amelynél másodpercenként egy mól reakciótermék keletkezik (egy mól szubsztrát eltűnik).
Az enzimek jellemzésére a fajlagos aktivitás értékét is használjuk. Ez az egység az enzim egységnyi tömegre eső aktivitását tükrözi, és µmol/perc fehérjemg-ben van kifejezve. A fajlagos aktivitás mértékegységei az enzimkészítmények tisztaságának értékelésére szolgálnak. Minél nagyobb a fajlagos aktivitás értéke, annál tisztább az enzimkészítmény.
Az enzimkinetika az enzimek által katalizált reakciók sebességét vizsgálja a szubsztráttal való kölcsönhatásuk különböző körülményeitől (koncentráció, hőmérséklet, pH, stb.) függően.
Az enzimek azonban olyan fehérjék, amelyek érzékenyek a különféle külső hatásokra. Ezért az enzimreakciók sebességének vizsgálatakor elsősorban a reaktánsok koncentrációját veszik figyelembe, és igyekeznek minimalizálni a hőmérséklet, a közeg pH-értéke, az aktivátorok, inhibitorok és egyéb tényezők hatását, és a standard feltételeket megteremteni. Először is, ez a táptalaj optimális pH-értéke ennek az enzimnek. Másodszor, ajánlatos a hőmérsékletet 25°C-on tartani, ahol lehetséges. Harmadszor, elérjük az enzim teljes telítését a szubsztráttal. Ez a pont különösen fontos, mivel alacsony szubsztrátkoncentrációnál nem minden enzimmolekula vesz részt a reakcióban (6.5. ábra, a), ami azt jelenti, hogy az eredmény messze lesz a lehetséges maximumtól. A katalizált reakció legnagyobb teljesítménye, egyéb tényezők azonossága mellett, akkor érhető el, ha az egyes enzimmolekulák részt vesznek az átalakulásban, pl. az enzim-szubsztrát komplex nagy koncentrációjában (6.5. ábra, ban ben). Ha a szubsztrát koncentrációja nem biztosítja az enzim teljes telítettségét (6.5. ábra, b), akkor a lezajló reakció sebessége nem éri el a maximális értéket.
Rizs. 65.
a - alacsony szubsztrátumkoncentrációnál; 6 - az aljzat elégtelen koncentrációjával; ban ben - amikor az enzim teljesen telítődik a szubsztráttal
A fenti körülmények között mért enzimreakció sebességét és az enzim szubsztráttal való teljes telítését ún. az enzimreakció maximális sebessége (V).
Az enzimreakció sebességét akkor határozzuk meg, amikor az enzim nincs teljesen telítve a szubsztráttal. v.
Az enzimatikus katalízis leegyszerűsítve a séma segítségével írható le
ahol F jelentése enzim; S - hordozó; FS - enzim-szubsztrát komplex.
Ennek a folyamatnak minden szakaszát egy bizonyos sebesség jellemez. Az enzimreakció sebességének mértékegysége a szubsztrát időegységre átszámított móljainak száma.(mint a normál reakció sebessége).
Az enzim és a szubsztrát kölcsönhatása enzim-szubsztrát komplex kialakulásához vezet, de ez a folyamat visszafordítható. Az előre és fordított reakciók sebessége a reaktánsok koncentrációjától függ, és a megfelelő egyenletek írják le:
A (6.3) egyenlet egyensúlyban érvényes, mivel az előre és a fordított reakció sebessége egyenlő.
A direkt (6.1) és a fordított (6.2) reakciók sebességét behelyettesítve a (6.3) egyenletbe, megkapjuk az egyenlőséget:
Az egyensúlyi állapotot a megfelelő egyensúlyi állandó K p, egyenlő a direkt és fordított reakciók állandóinak arányával (6.5). Az egyensúlyi állandó reciproka ún szubsztrát állandó K s , vagy az enzim-szubsztrát komplex disszociációs állandója:
A (6.6) egyenletből jól látható, hogy az enzim-szubsztrát komplex nagy koncentrációja esetén a szubsztrátállandó csökken, i.e. nagy stabilitással. Ezért a szubsztrát állandó jellemzi az enzim és a szubsztrát affinitását, valamint az enzim-szubsztrát komplex képződésének és disszociációjának sebességi állandóinak arányát.
Egy enzim szubsztráttal való telítésének jelenségét Leonor Michaelis és Maud Mepten tanulmányozta. Az eredmények matematikai feldolgozása alapján levezették a (6.7) egyenletet, amely a nevüket is kapta, amelyből jól látható, hogy magas szubsztrátkoncentrációnál és alacsony szubsztrátállandónál az enzimreakció sebessége hajlamos. maximumra. Ez az egyenlet azonban korlátozott, mert nem veszi figyelembe az összes paramétert:
Az enzim-szubsztrát komplex a reakció során különböző irányban átalakulhat:
- disszociálnak az eredeti anyagokká;
- olyan termékké kell alakítani, amelyből az enzim változatlan formában elválik.
Ezért az enzimatikus folyamat összhatásának leírására a fogalom Michaelis állandók K t, amely az enzimatikus katalízis mindhárom reakciója sebességi állandóinak összefüggését fejezi ki (6.8). Ha mindkét tagot elosztjuk az enzim-szubsztrát komplex képződési reakciójának sebességi állandójával, akkor a (6.9) kifejezést kapjuk:
A (6.9) egyenletből egy fontos következmény következik: a Michaelis-állandó mindig nagyobb, mint a szubsztrátállandó k 2 /kv
Számszerűen K t egyenlő a szubsztrát olyan koncentrációjával, amelynél a reakciósebesség a maximális lehetséges sebesség fele, és megfelel az enzim szubsztráttal való ilyen telítettségének, mint az 1. 6,5, b. Mivel a gyakorlatban nem mindig lehet elérni az enzim teljes telítettségét a szubsztráttal, így van K t az enzimek kinetikai jellemzőinek összehasonlítására szolgál.
Az enzimes reakció sebessége az enzim szubsztráttal való nem teljes telítettsége esetén (6.10) az enzim-szubsztrát komplex koncentrációjától függ. Az arányossági együttható az enzim és a termék felszabadulásának reakcióállandója, mivel ez megváltoztatja az enzim-szubsztrát komplex koncentrációját:
Az átalakítások után a fent bemutatott függőségek figyelembevételével az enzimreakció sebességét az enzim szubsztráttal való nem teljes telítődése esetén a (6.11) egyenlet írja le, azaz. az enzim, a szubsztrát koncentrációjától és azok affinitásától függ Ks:
Az enzimreakció sebességének grafikus függése a szubsztrát koncentrációjától nem lineáris. Amint az az ábrából nyilvánvaló. 6.6, a szubsztrát koncentrációjának növekedésével az enzim aktivitásának növekedése figyelhető meg. Ha azonban az enzim a szubsztráttal maximális telítettséget ér el, az enzimreakció sebessége maximális lesz. Ezért a reakciósebességet korlátozó tényező az enzim-szubsztrát komplex kialakulása.
A gyakorlat azt mutatja, hogy a szubsztrátok koncentrációit általában egységnél (10 6-10 3 mol) sokkal kisebb értékekben fejezik ki. Elég nehéz ilyen mennyiségekkel operálni a számításokban. Ezért G. Lineweaver és D. Burke azt javasolta, hogy az enzimreakció sebességének grafikus függését ne direkt koordinátákkal, hanem inverzekkel fejezzék ki. Abból a feltevésből indultak ki, hogy egyenlő értékek esetén a reciprok is egyenlők:
Rizs. 6.6.
A (6.13) kifejezés transzformációja után egy kifejezést kapunk, ún Lineweaver-Burk egyenlet (6.14):
A Lineweaver-Burk egyenlet grafikus függése lineáris (6.7. ábra). Az enzim kinetikai jellemzőit a következőképpen határozzuk meg:
- az y tengelyen levágott szakasz egyenlő 1/V;
- az x tengelyen levágott szakasz -1 /K t.
Rizs. 6.7.
Úgy gondolják, hogy a Lineweaver - Burke módszer lehetővé teszi a maximális reakciósebesség pontosabb meghatározását, mint a közvetlen koordinátákban. Ebből a grafikonból értékes információk nyerhetők ki az enzimgátlásról is.
Vannak más módok is a Michaelis-Menten egyenlet átalakítására. A grafikus függőségeket különféle külső hatások enzimatikus folyamatokra gyakorolt hatásának tanulmányozására használják.