Разное

Технологическая карта проведения практического занятия. Санитарная микробиология Морфология сифилиса

Содержание статьи

Бледная трепонема

Морфология и физиология

T.pallidum имеет форму спирали, протоплшматический цилиндр, который скручен в 8-12 завитков. От концов клетки отходят 3 периплазматических жгутика. Бледная трепонема плохо воспринимает анилиновые красители, поэтому ее окрашивают краской Романовского-Гимза. Однако наиболее эффективным методом является ее изучение в темнопольном или фазовоконтрастном микроскопе. Микроаэрофил. На искусственных питательных средах не растет. Т. pallidum культивируют в ткани яичка кролика, где она хорошо размножается и полностью сохраняет свои свойства, вызывая у животного орхит. Антигены. Антигенная структура Т. pallidum сложная. Она связана с белками наружной мембраны, липопротеидами. Последние являются перекрестно реагирующими антигенами, общими для человека и крупного рогатого скота. Они используются в качестве антигена в реакции Вассермана для серодиагностики сифилиса.

Патогенность и патогенез

К факторам вирулентности бледной трепонемы относят белки наружной мембраны и ЛПС, проявляющие свои токсические свойства после освобождения из клетки. Вместе с тем, по-видимому, способность трепонемы при делении образовывать отдельные фрагменты, проникающие вглубь тканей, также можно отнести к факторам вирулентности. В патогенезе сифилиса различают три стадии. При первичном сифилисе наблюдается образование первичного очага - твердого шанкра в месте входных ворот инфекции, с последующим проникновением в регионарные лимфоузлы, где возбудитель размножается и накапливается. Первичный сифилис продолжается около 6 недель. Вторая стадия характеризуется генерализацией инфекции, сопровождающейся проникновением и циркуляцией возбудителя в крови, что сопровождается кожными высыпаниями. Продолжительность вторичного сифилиса у нелеченых больных колеблется в пределах 1-2 лет. В третьей стадии обнаруживаются инфекционные гранулемы (гуммы, склонные к распаду), локализующихся во внутренних органах и тканях. Данный период у нелеченых больных продолжается несколько лет и заканчивается поражением ЦНС (прогрессивный паралич) либо спинного мозга (спинная сухотка).

Иммунитет

При сифилисе имеет место гуморальный и клеточный иммунный ответ. Образующиеся антитела не обладают протективными свойствами. Клеточный иммунный ответ связан с фиксацией возбудителя и образованием гранулем. Однако элиминации трепонем из организма при этом не происходит. Вместе с тем неблагоприятные условия среды индуцируют образование трепонемами цист, которые локализуются в стенке кровеносных сосудов. Полагают, что это свидетельствует о переходе заболевания в стадию ремиссии. Наряду с цистами трепонемы образуют L-формы. При сифилисе формируется ГЗТ, которая может быть выявлена кожно-аллергической пробой с убитой взвесью трепонем. Полагают, что проявление третичного периода сифилиса связано с ГЗТ.

Экология и эпидемиология

Сифилис - типично антропонозная инфекция. Болеют только люди, которые являются резервуаром инфекции в природе. Передача инфекции происходит половым путем и значительно реже - через белье и другие предметы. Во внешней среде (воздух) трепонемы быстро погибают.

Сифилис и другие трепонематозы

Сифилис - хроническая инфекционная венерическая болезнь человека, имеет циклический прогрессирующее течение, поражает кожу, слизистые оболочки, внутренние органы и нервную систему. Возбудителем заболевания является Treponema pallidum.Различают три основные периоды развития сифилиса, методы лабораторной диагностики которых имеют свои особенности. В ранний период болезни материалом для лабораторной диагностики служит выделение из твердого шанкра, пунктат с лимфатических узлов, соскобы с розеол, сифилид подобное. При вторичном и третичном периодах исследуют сыворотку крови и ликвор.В связи с тем, что выделение чистых культур трепонем в обычных бактериологических лабораториях невозможно, во время первичного периода болезни (редко позже) проводят бактериоскопический метод диагностики. Начиная с вторичного периода, используют, в основном, серологические методы.

Бактериоскопическое исследования

Перед взятием патологического материала сначала сифилитическую язву протирают ватным тампоном, для удаления сального налета и контаминуючои микрофлоры. Затем дно твердого шанкра раздражают скальпелем или металлической лопаточкой или энергично сжимают язву с боков пальцами в резиновой перчатке к выделению раневого экссудата. При небольшомколичества прозрачной жидкости ее можно внести в каплю 0,85% раствора хлорида натрия. При невозможности взять материал со дна шанкра (фимоз, рубцевание язвы и др.) проводят пункцию регионарных лимфатических узлов.Каплю жидкости из язвы или пунктата наносят на тонкое предметное стекло (1,1-1,2 мм), накрывают покровным стеклом и исследуют в темном поле зрения (краще!), или с помощью фазово-контрастного или аноптрального микроскопа.Бледная трепонема в темном поле зрения имеет вид слегка блестящей тонкой нежной спирали с крутыми равномерными округлыми первичными завитками. Движения плавные, тем она изгибается под углом. Но особенно характерные для нее Маятникообразные колебания. Возбудитель сифилиса необходимо отличать от Treponema refringens (что колонизирует наружные половые органы), которая толще, грубее, с неравномерными крупными завитками и имеет активные беспорядочные движения, но не сгибается. Трепонемы фузосп-ирохетозного симбиоза отличаются тонким рисунком, пологими завитками и беспорядочным движением.При диагностике ротового сифилиса бледную трепонему следует дифференцировать и от зубных трепонем, особенно Т. dentium, а также от Т. buccalis. Первую из них вообще трудно отличить от сифилитического. Она, правда, короче, имеет 4-8 острых завитков, маятникообразное движение отсутствует. Т. buccalis толще, имеет грубые первоначальные завитки и беспорядочное движение.При любых сомнениях нужно учитывать, что все сапрофитные трепонемы, в отличие от бледной, хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Они не проникают в лимфатические узлы, поэтому исследования пунктатов имеет большую диагностическую ценность. Выявление в пунктате лимфатических узлов типовых трепонем беспрекословно подтверждает диагноз сифилиса.Итак, темнопольная исследования надавленные капли является наилучшим методом выявления возбудителя сифилиса. Его преимущества заключаются в том, что материал исследуют быстро, а морфология трепонем в живом состоянии наиболее характерна. Тушови мазки по методу Бурри теперь не используют.В случае невозможности провести исследование в темном поле зрения можно использовать различные методы окрашивания. Бледная трепонема плохо воспринимает анилиновые красители. Из многих предложенных способов окраски лучшие результаты получают при использовании окраски по Романовеьким-Гимзе. Изготовленные мазки фиксируют метиловым спиртом или в смеси Никифорова. Четкость результаты получают, когда краску Романовского-Гимзы наливают в препарат. Для этого в чашку Петри помещают обломки спичек, на них помещают предметное стекло мазком вниз и наливают краситель до тех пор, пока он смочите мазок. Время окраски при этом удваивают. При микроскопии бледные трепонемы имеют нежно-розовый цвет, а другие виды трепонем окрашиваются в синий или сине-фиолетовый цвет.Можно использовать и метод серебрения Морозовым. Трепонемы полностью сохраняют свои морфологические особенности и выглядят под микроскопом коричневыми или почти черными. Но посеребренные препараты долго не хранятся. В последнее время методы окрашивания трепонем применяют редко.Если начато лечение сифилиса химиопрепаратами, выявить возбудитель в патологических материалах даже с помощью темного поля зрения практически не удается. При получении отрицательного анализа его необходимо повторить.

Серологическая диагностика сифилиса

При проведении серологических реакций теперь используют следующие унифицированные в Украине методы исследований: реакции связывания комплемента (РСК), иммунофлуоресценции (РИФ), иммобилизации трепонем (PIT), микрореакцию преципитации (МПР) и иммуноферментный анализ (ИФА).На протяжении многих лет основной и наиболее распространенной реакцией считалась реакция связывания комплемента или реакция Вассермана (РВ, RW). Для ее постановки используют сыворотку крови больного сифилисом и спинномозговую жидкость при поражении нервной системы.Методика постановки реакции Вассермана не отличается от техники проведения РСК. Разница лишь в том, что для РО используют не только специфический трепонемный, а неспецифический кардиолипиновый антиген.l Взятие 5-10 мл крови из локтевой вены проводят натощак или не ранее 6 часов после приема пищи. Нельзя брать кровь у больных с повышенной температурой, после употребления алкоголя и жирной пищи, у беременных женщин за 10 дней до родов и рожениц. Добытую из крови сыворотку прогревают при температуре 56 ° С в течение 30 мин для инактивации собственного комплемента. РО обязательно ставят с двумя антигенами: специфическим и неспецифическим.Специфический ультраозвучений трепонемный антиген готовят из культур бледных трепонем (штамм Рейтера), выращенных в пробирках и подверженных действию ультразвука. Его выпускают в виде лиофильно высушенного порошка. Неспецифический кардиолипиновый антиген готовят путем спиртового экстрагирования липидов с бычьего сердца и очистки от балластных смесей, расфасовывают в ампулы по 2 мл. Для введения антигена в РО его титруют согласно данной инструкции. Непосредственно перед постановкой РВ проводят титрование комплемента и гемолитической сыворотки по такой же схеме, как и в РСК. Реакцию Вассермана ставят как качественным, так и количественным методом. Качественную реакцию проводят в трех пробирках с двумя антигенами по обычной схеме.Результаты реакции оценивают по 4 плюсовой системе: положительная реакция - когда есть полная или значительная задержка гемолиза (4 +, 3 +); слабоположительная реакция - частичная задержка гемолиза (2 +); сомнительная реакция - незначительная задержка гемолиза (1 +). В случае возникновения полного гемолиза РО считают отрицательной.Каждую сыворотку, которая дала положительную качественную реакцию, необходимо исследовать и количественным методом с последовательным ее разведением от 1:10 до 1:640.Титром исследуемой сыворотки (титр реагинов) считают то максимальное ее разведение, при котором наступает полная (4 +) или значка (3 +) задержка гемолиза. Количественный метод постановки РО имеет важное значение для оценки эффективности лечения сифилиса. Быстрое снижение титра реагинов указывает на успешную терапию. Если титр сыворотки долго не снижается, это свидетельствует об отсутствии эффективности применяемых препаратов и необходимость изменить тактику лечения.При пилозри на серонегативный первичный сифилис или скрытый, третичный или врожденный, рекомендуют ставить реакцию Вассермана на холоде по той же схеме. В случае подозрения на нейросифилис РО проводят со спинномозговой жидкостью, которую инактивируют, поскольку она не содержит собственного комплемента. В реакцию вводят неразведенный ликвор и в разведениях 1:2 и 1:5.Реакция Вассермана становится положительной через 2-3 недели после появления твердого шанкра. При вторичном сифилисе она выпадает положительной в 100% случаев, в третичном - в 75%.Кроме того, в комплексе серологических реакций (КСР) как скрининг-тест используют микрореакцию преципитации с плазмой крови или инактивированной сывороткой.

Микрореакция преципитации

Микрореакцию преципитации ставят с кардиолипиновым антигеном. Принцип реакции заключается в том, что при добавлении к плазме или сыворотке крови больного сифилисом эмульсии кардиолипинового антигена образуется преципитат (комплекс антиген-антитело), который осаждается в виде хлопьев белого цвета. Пользуются такой методике: в лунку пластины вносят пипеткой три капли плазмы (или инактивированной сыворотки), затем добавляют одну каплю эмульсии стандартного кардиолипинового антигена. Компоненты реакции смешивают встряхиванием пластины в течение 5 мин, после чего добавляют три капли 0,9% раствора хлорида натрия и оставляют при комнатной температуре еще на 5 мин. Обязательном контроле со слабоположительный сывороткой крови. Результаты оценивают невооруженным глазом над искусственным источником освещения. При появлении в лунке крупных хлопьев реакцию считают положительной (4 +, 3 +), средних и мелких - как слабоположительные (2 +, 1 +). При отрицательном результате преципитат не образуется.Микрореакцию преципитации можно проводить и количественным методом для установления титра преципитирующих антител и оценки на этой основе эффективности лечения. Более высокие титры МРП получают с плазмой, чем с сывороткой. За рубежом аналогом МРП с сывороткой больного является VDRL (Veneral disease research laboratoiy), а с плазмой - RPR (Rapid plasma reagin).

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

К группе специфических реакций, которые широко употребляются для серологической диагностики сифилиса, относится непрямая реакция иммунофлюоресценции. Как антиген, в ней используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из паренхимы яичек кролика на 7-й день после заражения. Реакцию ставят в двух модификациях: РИФ-АБС и РИФ-200. В первом варианте используют сорбент антител (соникат) - ультраозвучений трепонемный антиген для РСК. Его выпускает Каунасское предприятие по производству бактерийных препаратов (Литва). При варианте РИФ-200 сыворотку больного разводят в 200 раз с целью снять влияние групповых протитрепонемних антител.Постановку РИФ-АБС проводят на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах. На обратной стороне стекол стеклорезом обозначены 10 кружочков диаметром 0,7 см. В рамках кружка на стекло наносят антиген - взвесь бледных трепонем - в таком количестве, чтобы в поле зрения их было 50-60. Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем и 10 мин в ацетоне. В отдельную пробирку вносят 0,2 мл сорбента (соникату) и 0,5 мл сыворотки крови больного, хорошо перемешивают. Смесь наносят на мазок (антиген) так, чтобы равномерно его покрыть, выдерживают 30 мин во влажной камере при 3 7 ° С (II фаза реакции). После этого мазок промывают фосфатным буфером, высушивают и наносят на него антишобулинову флуоресцентных сыворотку на 30 мин, ставят во влажную камеру при 37 ° С (II фаза). Препарат вновь промывают фосфатным буфером, высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом.При положительной реакции бледные трепонемы излучают золотисто-зеленый свет, при отрицательной - не светятся.Техника постановки РИФ-200 такое же, как и РИФ-АБС, только сыворотку крови больного предварительно разводят в 200 раз фосфатным буфером. При проведенииреакции иммунофлюоресценции со спинномозговой жидкостью больного сифилисом нервной системы используют РИФ-ц и РИФ-10, т.е. ликвор вводят в реакцию неинактивованим и разведенным, или разведенным 1:10.

Реакция имобилизации бледных трепонем (PИT)

Реакция имобилизации бледных трепонем (PИT) основан на феномене потери их подвижности в присутствии иммобилизирующие протитрепонемних антител сыворотки больного и комплемента в условиях анаэробиоза. Как антиген в реакции используют взвесь бледных трепонем из тестикулярной ткани кролика, зараженного лабораторным штаммом Никольса. Взвесь разводят стерильным 0,85% раствором хлорида натрия так, чтобы в поле зрения было 10-15 спирохет.Для проведения реакции в стерильной пробирке смешивают 0,05 мл сыворотки крови больного, 0,35 мл антигена и 0,15 мл комплемента. Опыт сопровождают контролями сыворотки, антигена и комплемента. Пробирки помещают в анаеростат, создают анаробни условия и выдерживают в термостате 18-20 ч при температуре 35 ° С. Затем из каждой пробирки готовят препарат надавленные капли, подсчитывают не менее 25 трепонем и отмечают, сколько из них подвижных и сколько неподвижных. Процент специфической иммобилизации бледных трепонем подсчитывают по формуле: х = (А-В) / В * 100, где X - процент иммобилизации, А - число подвижных трепонем в контрольной пробирке, В - число подвижных трепонем в опытной пробирке. Реакция считается положительной, когда процент иммобилизации составляет 50 и более, слабоположительный - от 30 до 50, сомнительной - от 20 до 30 и отрицательной - от 0 до 20.В практических лабораториях используют более простой меланжерний метод PIT за М.М. Овчинниковым. Анаэробные условия опыта создаются помещением реагирующей смеси (сыворотки, антиген, комплемент) в меланжеры, оба конца которого закрывают резиновым кольцом. Меланжерна методика позволяет обойтись без сложного оборудования и аппаратуры для создания анаэробиоза, но дает такие результаты, которые не посту паються классической микроанаеростатний методике.Реакции иммобилизации трепонем и иммунофлуоресценции считают наиболее специфичными в серологической диагностике сифилиса. И все же, PIT, несмотря на ее специфичность, не рекомендуют для использования в широкой практике из-за трудоемкости постановки.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят как с кадриолипиновим антигеном (неспецифическая, отборочная реакция), так и трепонемным (специфическая реакция), которая подтверждает диагноз сифилиса.Принцип непрямого метода ИФА заключается в том, что в антигена, адсорбированного на твердой фазе в лунках планшета вносят исследуемую сыворотку. Если она содержит антитела против трепонем, образуется комплекс антиген-антитело (II фаза). После отмывания несвязанных неспецифических антител в лунки вносят антиглобулинову сыворотку, конъюгированные с ферментом (чаще всего с пероксидазой хрена). Конъюгат прочно присоединяется к комплексу антиген-антитело (II фаза).После отмывания несвязанного конъюгата в лунки добавляют окрашивающий субстрат ОФД - ортофенилендиамин (III фаза). Пероксидазную реакцию останавливают, добавляя серную кислоту. Для контроля ставят такие же пробы с положительным и заведомо отрицательной сыворотками.Учет результатов анализа проводят с помощью фотометра, который определяет оптическую плотность в двухволновом режиме (492 нм и 620 нм). Для постановки реакции ензиммичених антител, кроме фотометра, нужны одно-и восьмиканальные автоматические пипетки с полипропиленовым наконечником и соответствующие наборы диагностических тест-систем.Метод ИФА находит широкое применение в серологической диагностике сифилиса. Он одинаково эффективен для выявления болезни в инкубационном периоде (через 1-2 недели после инфицирования), при клинических проявлениях болезни и скрытых его формах. Очень часто ИФА используют при скрининговых обследованиях населения, особенно на станциях переливания крови.В лабораторной практике иногда применяют также реакцию иммунной прилипания (РИП) и реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА). Первая из них основывается на том, что патогенные тестикулярные трепонемы штамма Никольса при смешивании с сывороткой больного в присутствии комплемента и эритроцитов человека прилипают к поверхности красных кровяных телец. РНГА достаточно широко используется для диагностики сифилиса благодаря своей методической простоте. Она становится положительной уже через три недели после заражения. Положительный результат реакции остается годами после выздоровления. Аналогом этой реакции за рубежом является ТРНА (Treponema pallidum haemoagglutination).

Treponema pallidum - возбудитель сифилиса включен в род Treponema (от лат. trepo - поворачивать, nemo - нить).

Т. pallidum открыта Ф. Шаудином в 1905 г. Большой вклад в изучение сифилиса внесли И. И. Мечников, П. Эрлих, Д. К. Заболотный и др.

Морфология . Т. pallidum - спиралевидная нить размером 8-18 × 0,08-0,2 мкм с мелкими, равномерными завитками. Число завитков 12-14. Концы трепонемы заострены или закруглены. Трепонемы подвижны. Обладают четырьмя видами движения. По Романовскому - Гимзе окрашиваются в бледно-розовый цвет, поэтому они называются Т. pallidum - бледная трепонема. Плохое окрашивание объясняется малым содержанием нуклеопротеидов. Спирохеты можно выявлять в препаратах, окрашенных по Бурри, серебрением. Кроме того, их изучают в живом состоянии - в темном поле.

Возбудители сифилиса спор и капсул не имеют (см. рис. 4).

Культивирование . Бледные трепонемы очень требовательны к питательным средам. На искусственных питательных средах они растут только в присутствии кусочков мозга или почек кролика и асцитической жидкости. Растут медленно, 5-12 дней при температуре 35-36° С в анаэробных условиях. Бледные трепонемы хорошо размножаются в курином эмбрионе (поперечным делением). При выращивании на искусственных питательных средах трепонемы теряют вирулентность. Такие культуры называются культуральными. Культуры, выращенные в курином эмбрионе, называют тканевыми. Они обычно сохраняют вирулентность.

Ферментативными свойствами трепонемы не обладают. Однако культуральные штаммы различаются между собой по способности образовывать индол и сероводород.

Токсинообразование . Не установлено.

Антигенная структура . Бледная трепонема содержит несколько антигенных комплексов: полисахаридный, липидный и протеиновый. Серогруппы и серовары не установлены.

Устойчивость к факторам окружающей среды . Бледные трепонемы малоустойчивы. Температура 45-55° С губит их через 15 мин. К низким температурам они устойчивы. При замораживании сохраняются до года. Спирохеты чувствительны к солям тяжелых металлов (ртути, висмута, мышьяка и др.). Обычные концентрации дезинфицирующих веществ губят их в течение нескольких минут. Они чувствительны к бензилпенициллину, бициллину и др. Под влиянием некоторых факторов внешней среды и антибактериальных препаратов трепонемы могут образовывать цисты. В такой форме они длительно находятся в организме в латентном состоянии.

Восприимчивость животных . В естественных условиях животные сифилисом не болеют. Однако на обезьянах, как показали И. И. Мечников и Э. Ру, можно воспроизвести клиническую картину сифилиса: на месте введения образуется твердый шанкр. В настоящее время показано, что при заражении кроликов, морских свинок на месте введения или в другом месте на коже образуются язвы. На кроликах путем пассажей можно длительное время сохранять выделенный штамм трепонем.

Источники инфекции . Больной человек.

Пути передачи . Контакт бытовой (прямой контакт), преимущественно половой путь. Иногда сифилис может передаваться через предметы (посуду, белье). От больной сифилисом матери заболевание передается через плаценту ребенку (врожденный сифилис).

Патогенез . Входными воротами являются слизистые оболочки половых путей и ротовой полости.

Первичный период - спирохеты попадают на слизистую оболочку, и после инкубационного периода (в среднем 3 нед) на месте внедрения образуется язва, которая характеризуется плотными краями и дном - твердый шанкр. Образованию твердого шанкра сопутствует увеличение лимфатических узлов. Первичный период продолжается 6-7 нед.

Вторичный период - возбудители сифилиса по лимфатическим и кровеносным путям распространяются по всему организму. При этом на коже и слизистых оболочках образуются розеолы, папулы, везикулы. Продолжительность этого периода - 3-4 года.

Третий период - развивается при нелеченом сифилисе. В этот период в органах, тканях, костях, сосудах образуются грануляционные разрастания - гуммы или гуммозные инфильтраты, склонные к распаду. Этот период может продолжаться несколько лет (в скрытой форме). Больной в этот период незаразен. При нелеченом сифилисе (в некоторых случаях), спустя много лет, может наступить поражение центральной нервной системы: при поражении головного мозга - прогрессивный паралич, при поражении спинного мозга - спинная сухотка. Эти заболевания возникают при локализации трепонем в мозговой ткани, что приводит к тяжелым органическим и функциональным изменениям в организме.

Иммунитет . Естественного иммунитета нет. При заболевании сифилисом развивается "нестерильный" инфекционный иммунитет. Его называют шанкерный, так как при повторном заражении твердый шанкр не образуется, но все последующие периоды развиваются. При сифилисе обнаруживают IgC и IgM, а также реагины IgE, которые в присутствии кардиолипидного антигена связывают комплемент.

Профилактика . Санитарно-просветительная работа, раннее выявление больных сифилисом. Специфическая профилактика. Не разработана.

Лечение . Пенициллин, бициллин, биохинол и др.

Контрольные вопросы

1. Опишите морфологию спирохет и методы окраски.

2. Что такое твердый шанкр?

3. Какой материал для исследования Вы будете брать в разные периоды заболевания сифилисом?

4. Каков иммунитет при сифилисе?

Микробиологическое исследование

Цель исследования: выявление бледной трепонемы и серодиагностика.

Материал для исследования

1. Содержимое твердого шанкра (первичный период).

2. Содержимое розеол, папул, везикул (вторичный период).

3. Кровь (вторичный, третий и четвертый периоды).

Основные методы исследования

1. Микроскопический.

2. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

3. Серологический: 1) реакция Вассермана (РСК);

2) осадочные реакции.

4. Реакция иммобилизации трепонем (РИТ).

Серологическая диагностика

Реакция Вассермана . Реакцию ставят по принципу реакции связывания комплемента (табл. 52). Отличается она тем, что при реакции Вассермана может быть использован неспецифический антиген. Например, липоидный экстракт из бычьего сердца - кардиоантиген. Ввиду неспецифичности антител, реагирующих с этим антигеном, их называют реагинами. Реакция с неспецифическим антигеном объясняется тем, что в сыворотке крови больного повышается содержание глобулинов и изменяется степень их дисперсности. Глобулины, вступая в соединение с липидными экстрактами, образуют комплекс, который связывает комплемент, и поэтому гемолиз не происходит (в гемолитической системе). Отсутствие гемолиза - положительная реакция - серологически подтверждает диагноз "сифилис". При постановке серологических реакций нужно использовать также специфические антигены из тканевых трепонем и культуральные.

Примечание. 1) ++++ полная задержка гемолиза; - гемолиз; 2) антиген № 1 неспецифический (липоидная фракция бычьего сердца); 3) антигены № 2 и 3 специфические, приготовленные из культур трепонем.

Осадочные реакции . 1. Реакция Кана. Сыворотку больного инактивируют при 56° С 30 мин. К антигену (экстракт липидов бычьего сердца) прибавляют 0,6% холестерина для повышения чувствительности реакции (табл. 53).

Учет результата: появление преципитации отмечается как положительная реакция .

2. Реакция Закса - Витебского (цитохолевая осадочная реакция) является модификацией реакции Кана. Авторы применили более концентрированный антиген, к которому прибавлен холестерин, что способствует более быстрому образованию преципитата.

Реакция иммобилизации трепонем (РИТ) . Это наиболее специфичная реакция в диагностике сифилиса.

В настоящее время разработана методика этой реакции: взвесь трепонем получают из измельченного яичка кролика, зараженного Т. pallidum, и сохраняют в специальной среде, не угнетающей подвижность трепонем. В пробирку вносят 1,7 мл взвеси тканевых трепонем, добавляют 0,2 мл испытуемой сыворотки, 0,1 мл свежего комплемента.

Контроли: в 1-ю пробирку вместо испытуемой сыворотки вносят сыворотку здорового лица; во 2-ю - наливают инактивированную сыворотку морской свинки. Все пробирки помещают в эксикатор или анаэростат, заполняют их смесью газов (1 объем углекислоты и 19 объемов азота) и ставят в термостат при 35° С. Затем исследуемый материал наносят на стекло и изучают подвижность трепонем в темном поле. Принцип реакции заключается в том, что сыворотка больного сифилисом в присутствии комплемента угнетает движение бледной трепонемы. Определяют процент иммобилизованных трепонем.

Результат считают положительным, если иммобилизованных трепонем выше 50%; слабоположительным - от 30-50%; отрицательным - ниже 20%.

Контрольные вопросы

1. Какой материал используют для лабораторной диагностики сифилиса в разные периоды заболевания?

2. Каковы методы лабораторного исследования при диагностике сифилиса?

3. Какими антигенами нужно пользоваться при постановке реакции Вассермана?

4. Какие ингредиенты необходимы для постановки реакции иммобилизации трепонем (РИТ)? Какой материал берут у обследуемого, что в нем определяют?


Начиная с 4-й недели от момента появления твердого шанкра, наступает серо-позитивный период, когда с целью диагностики сифилиса можно ставить различные серологические реакции. Особенность серологического метода заключается в том, что могут быть использованы неспецифический и специфический антигены (соответственно неспецифические и специфические реакции).

  1. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЛИ РЕАГИНОВЫЕ ТЕСТЫ - в качестве антигена используют кардиолипиновый антиген (холестеринизированыий спиртовой экстракт из мышц бычьего сердца). Сюда относятся реакция связывания комплемента Вассермана, осадочные реакции, реакции микропреципитации.

  1. СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЛИ ТРЕПОНЕМАЛЬНЫЕ ТЕСТЫ основаны на выявлении в сыворотке крови больных антител к трепонемальному антигену (живые и убитые трепонемы, экстракты из трепонем). В качестве антигена могут быть использованы:
а) ТРЕПОНЕМЫ РЕЙТЕРА - культуральные спирохеты, выращенные на искусственной питательной среде и не обладающие вирулентностью;

Б) ТРЕПОНЕМЫ НИКОЛЬСА ИЛИ ТКАНЕВЫЕ ТРЕПОНЕМЫ - патогенные трепонемы, полученные при заражении кролика в яички бледной трепонемой.

Из трепонемальных тестов в настоящее время чаще всего используют иммунофлюоресцентный адсорбционный тест (ИФАТ) и трепонемальную микрогемагглютинацию. В обоих случая сыворотку больного предварительно адсорбируют трепонемами Рейтера для удаления антител к общим для всех видов спирохет антигенам. В качестве антигена в ИФАТ используют трепонемы Никольса, а в микрогемагглютинации -эритроциты с сорбированными на них антигенами трепонемы Никольса.

К трепонемальным тестам относятся также РСК (в качестве антигена используют взвесь убитых трепонем - трепонемы-Никольса) и реакция иммобилизации трепонем.
^

ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ ВАССЕРМАНА


Для постановки реакции связывания комплемента по Вассерману при подозрении на сифилис необходимы следующие компоненты:


  1. ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА БОЛЬНОГО в разведении 1:5. Исследуемую сыворотку необходимо прогреть в течение 30 минут при температуре 56 градусов для разрушения (инактивации) комплемента.

  2. НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЙ АНТИГЕН - кардиолипиновый антиген - холестеринизированный спиртовой экстракт из сердечной мышцы быка.

  3. КОМПЛЕМЕНТ - в качестве комплемента используют сыворотку морской свинки. Так как количество комплемента должно быть строго определенным, комплемент берут в рабочей дозе (титр, увеличенный на 25-30%). Титр комплемента - это минимальное его количество, при котором еще происходит гемолиз. Увеличение титра необходимо потому, что в реакции активность комплемента может быть подавлена другими ингредиентами реакции (спиртовой антиген и др.)

  4. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА - это смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов барана, которую перед постановкой РСК выдерживают в термостате при 37°С в течении 30 минут для адсорбции гемолизинов на поверхности эритроцитов.
Реакцию Вассермана ставят по общепринятой методике РСК. Отсутствие же гемолиза в опытной пробирке свидетельствует о положительной реакции Вассермана. Наличие гемолиза в опытной пробирке соответственно трактуется как отрицательная реакция Вассермана (человек здоров).

^ Схема постановки реакции Вассермана


Компоненты реакции
ste пробирки

1

(опыт)
2

(контроль АГ)
3

(контроль AT)

Инактивированная исследуемая сыворотка (1:5)
0,5
0,5
0,5

Кардиолипиновый антиген в рабочей дозе
0,5
0,5
-

Комплемент (в рабочей дозе)
0,5
0,5
0,5

Физиологический раствор
-
0,5
0,5

Инкубация при температуре 137°С - 40 минут.

Результат реакции оценивают по степени задержки гемолиза: ++++ - резкоположительная реакция (полное отсутствие гемолиза) +++ - положительная реакция ++и+ - слабоположительная реакция - отрицательная реакция

^ Специфическая профилактика и лечение. Специфическая профилактика не разработана. Неспецифическая профилактика предусматривает воздержание от случайных половых связей, ран­нее выявление больных, особенно со скрытой формой заболевания, и их своевременное и эффектив­ное лечение. Для лечения сифилиса используют антибиотики: пенициллин и его производные (водорастворимые и дюрантные формы), иногда эритромицин. Используют также препараты висму­та, мышьяка, ртути.

^ Проявления сифилиса в полости рта.

Сифилис - хроническое инфекционное заболевание, вызываемое блед­ной трепонемой. Сифилис характеризуется весьма своеобразным течени­ем: во-первых, волнообразной сменой активных проявлений и периодов скрыто протекающей инфекции; во-вторых, постепенным и последова­тельным изменением клинической и патологоанатомической картины по­ражений органов и тканей от слабовыраженных воспалительных явлений до образования специфических глубоких инфекционных гранулем, сдав­ливающих и разрушающих органы и ткани, в которых они локализуются, что приводит к потере функции органа, а иногда и к смерти больного.

Различают приобретенный и врожденный сифилис. Врожденный сифи­лис возникает при попадании бледной трепонемы в организм плода через плаценту от больной сифилисом матери. Для заражения человека сифили­сом необходимо проникновение бледной трепонемы через кожу или слизистую оболочку, целостность которой нарушена.

Обычно заражение происходит половым путем. Внеполовое заражение может быть профессиональным, например, у медицинских работников во время операций, вскрытий, стоматологического или гинекологического осмотра и т.д., или произойти при пользовании общей посудой, губной по­мадой, мундштуками и др.

В связи с волнообразным течением сифилиса, разным характером кли­нических и морфологических изменений, возникающих на различных эта­пах заболевания, различают инкубационный, первичный, вторичный и третичный периоды приобретенного сифилиса, а также скрытый, в том числе неведомый, висцеральный сифилис и сифилис нервной системы.

Инкубационный период сифилиса в среднем равен 3-4 нед., однако воз­можно как его укорочение (до 10-12 дней), так и удлинение (до 6 мес), ко­торое обычно связано с приемом во время инкубации небольшого количе­ства антибиотиков по поводу интеркуррентных заболеваний или гонореи.

^ Первичный период сифилиса начинается с возникновения на месте зара­жения, т.е. внедрения бледной трепонемы, твердого шанкра (первичная сифилома). Первичный период длится 6-7 нед. Спустя 5-7 дней после об­разования твердого шанкра появляется второй непременный симптом пер­вичного периода - увеличиваются регионарные лимфатические узлы (бу­бон, или регионарный склераденит). В этих узлах происходит бурное раз­множение трепонемы. Из лимфатических узлов по лимфатическим путям уже в начале первичного периода трепонемы попадают в кровь, в ответ на это постепенно начинают вырабатываться антитела, которые в конце 3-й недели первичного периода сифилиса можно определить в крови с по­мощью классических серологических реакций (реакция Вассермана, оса­дочные реакции), несколько раньше - с помощью реакции иммунофлюоресценции (РИФ), а несколько позднее - и с помощью реакции иммоби­лизации бледных трепонем (РИБТ, или РИТ).

Примерно у 20% больных к концу первичного периода сифилиса разви­ваются общие симптомы (повышение температуры тела до 38-38,5°С, сла­бость, головная боль, боли в костях, особенно по ночам), в периферичес­кой крови наблюдаются небольшая анемия, лейкоцитоз, увеличение СОЭ. Спустя 4-6 дней на этом фоне на коже туловища, а нередко и на слизис­той оболочке полости рта появляется сыпь, что свидетельствует об оконча­нии первичного и начале вторичного периода сифилиса.

Слизистая оболочка полости рта и красная кайма губ являются локали­зацией сифилитических высыпаний во всех стадиях заболевания, в том числе и при первичном сифилисе. При внеполовых заражениях локализа­ция шанкра на губах и слизистой оболочке полости рта встречается наибо­лее часто. Твердый шанкр может возникнуть на любом участке красной каймы губ или слизистой оболочки полости рта, но чаще всего он локали­зуется на губах, языке, миндалинах.

Развитие твердого шанкра на губе или слизистой оболочке полости рта, как и на других местах, начинается с появления ограниченной красноты, в основании которой в течение 2-3 дней возникает уплотнение за счет вос­палительного инфильтрата. Это ограниченное уплотнение постепенно увели­чивается и достигает обычно 1-2 см в диаметре. В центральной части пора­жения происходит некроз и образуется эрозия мясо-красного цвета, реже - язва. Достигнув полного развития в течение 1 -2 нед, твердый шанкр на сли­зистой оболочке обычно представляет собой круглую либо овальную, безбо­лезненную эрозию мясо-красного цвета или язву с блюдцеобразными краями размером от 3 мм (карликовые шанкры) до 1,5 см в диаметре с плотноэластическим инфильтратом в основании. В соскобе поверхности шанкра легко об­наруживаются бледные трепонемы. Иногда эрозии покрыты серовато-белым налетом. При расположении шанкра на губах иногда образуется значитель­ный отек, вследствие которого губа отвисает, а шанкр держится дольше, чем на других местах. Чаще развивается один твердый шанкр, реже - два и более. Если присоединяется вторичная инфекция, то эрозия может углубляться, при этом образуется язва с грязно-серым некротическим налетом.

На языке твердый шанкр обычно бывает одиночным, возникает чаще в средней трети. Помимо эрозивной и язвенной форм, у лиц со складчатым языком, при локализации твердого шанкра вдоль складок может возник­нуть щелевидная форма. При расположении твердого шанкра на спинке языка из-за значительного инфильтрата в основании шанкр обычно резко выступает над окружающей тканью, на его поверхности имеется мясо-красная эрозия. Обращают на себя внимание отсутствие воспалительных явлений вокруг шанкра и его безболезненность.

Твердый шанкр в области десен имеет вид ярко-красной гладкой эро­зии, которая в виде полулуния окружает один-два зуба. Язвенная форма твердого шанкра десны очень сходна с банальным изъязвлением и почти не имеет каких-либо признаков, характерных для первичной сифиломы. Ди­агностику облегчает наличие бубона в подчелюстной области.

При локализации на миндалине твердый шанкр может иметь одну из трех форм: язвенную, ангиноподобную (амигдалит) и комбинированную - язвенную на фоне ангиноподобной. Поражается миндалина на одной сто­роне. При язвенной форме миндалина увеличена, плотная, на этом фоне наблюдается мясо-красная овальная язва с пологами ровными краями. Слизистая оболочка вокруг язвы гиперемирована. Процесс сопровождает­ся болевыми ощущениями, иногда значительными. При ангиноподобном шанкре эрозия или язва отсутствует, имеется одностороннее значительное увеличение миндалины. Она приобретает медно-красный цвет, безболез­ненная, плотная. Процесс отличается от ангины односторонностью пора­жения, отсутствием болей и острой воспалительной гиперемии. Общих яв­лений нет, температура тела нормальная.

Шанкр на губах следует дифференцировать от простого пузырькового лишая, при котором в отличие от сифилиса высыпаниям предшествует жжение или зуд, эрозия располагается на гиперемированном, слегка отеч­ном основании и имеет микрополициклические очертания. Кроме того, при пузырьковом лишае эрозивным высыпаниям предшествуют пузырьки, которые никогда не возникают в процессе формирования шанкра. В отли­чие от твердого шанкра герпетические эрозии почти всегда характеризуют­ся быстрым возникновением и быстрой эпителизацией, кроме того, герпес в отличие от твердого шанкра часто имеет рецидивирующее течение. Сле­дует учесть, что при длительном существовании герпетической эрозии на губе в ее основании появляется инфильтративное уплотнение, что усилива­ет сходство эрозии с первичной сифиломой.

^ Вторичный период сифилиса начинается через 6-7 нед. после появления твердого шанкра, когда на фоне симптомов, свойственных первичному пе­риоду сифилиса (твердый шанкр, регионарный склераденит, полиаденит), появляется обильная розеолезно-папулезная сыпь. Вторичный период си­филиса продолжается в течение 3-5 лет и сопровождается положительны­ми серологическими реакциями. Особенностью вторичного периода си­филиса является волнообразное течение, когда периоды активного прояв­ления болезни сменяются периодами скрытого, бессимптомного течения болезни, причем продолжительность каждого из этих периодов индивиду­альна (в среднем по 1,5-2 мес).

Активная стадия заболевания, развивающаяся в начале вторичного пери­ода сифилиса вследствие генерализации инфекции, характеризуется боль­шим количеством розеолезно-папулезных, а иногда и пустулезных высыпа­ний, полиаденитом, склераденитом, остатками твердого шанкра и носит название вторичный свежий сифилис. К концу периода вторичного свеже­го сифилиса разрешается твердый шанкр, исчезают розеолезно-папулезные высыпания, ликвидируется регионарный склераденит и полиаденит.

Слизистая оболочка полости рта является частым местом локализации сифилидов вторичного периода, причем при вторичном рецидивном си­филисе высыпания во рту могут быть единственным клиническим прояв­лением болезни. Почти у половины больных с явлениями вторичного си­филиса наблюдаются поражения слизистой оболочки рта в виде розеолезных и папулезных элементов, пустулезные высыпания на слизистой обо­лочке рта возникают крайне редко.

Розеолезные высыпания на слизистой оболочке рта возникают симметрично на дужках, мягком небе, язычке и миндалинах. Особеннос­тью розеолезных высыпаний в этой области является то, что они сливают­ся в сплошные очаги поражения (эритематозная ангина). Пораженная об­ласть имеет застойно-красный цвет, иногда с медным оттенком, резкие границы. Слизистая оболочка в этой области слегка отечна; больные ощу­щают неловкость при глотании, болезненность, но субъективные ощущения могут и отсутствовать. Разрешение эритематозной ангины начинается с центральной части.

Наиболее частым проявлением вторичного сифилиса на слизистой обо­лочке рта являются папулезные высыпания. Они могут возникать в любом месте слизистой оболочки, но чаше на миндалинах, дужках, мяг­ком небе, где нередко папулы сливаются в сплошные очаги поражения (па­пулезная ангина), языке, слизистой оболочке щек, особенно по линии смыкания зубов, деснах и т.д. Вид папул зависит от длительности их суще­ствования. Вначале папула - резко ограниченный темно-красный очаг размером до 1 см в диаметре с небольшим инфильтратом в основании. Спу­стя некоторое время образующийся в результате происходящего воспале­ния экссудат пропитывает покрывающий папулу эпителий, и она приобре­тает весьма характерный вид.

^ Третичный период сифилиса наблюдается далеко не у всех больных, даже если они не лечатся. Он начинается через 4-6 лет после начала заболева­ния в связи с изменением реактивности организма, чувствительности его к бледной трепонеме и т.д. и имеет злокачественное течение. Третичный период может продолжаться десятилетиями, характеризуется развитием воспалительных инфильтратов (гумм и бугорков), склонных к распаду и нередко вызывающих значительные деструктивные, порой несовмести­мые с жизнью изменения в органах и тканях. В то же время высыпания тре­тичного сифилиса не заразны для окружающих, так как в их отделяемом отсутствуют бледные трепонемы.

В третичный период сифилиса на слизистой оболочке рта могут появиться гуммы, гуммозная диффузная инфильтрация и бугорковые высы­пания. При этом слизистая оболочка может быть единственным местом клинического проявления заболевания.

Гуммозный сифилид может локализоваться в любом месте слизи­стой оболочки рта. Чаще гуммы образуются на мягком и твердом небе и языке. Обычно гумма появляется в единственном числе. Вначале образу­ется безболезненный узел, который постепенно увеличивается, а затем вскрывается. Отторгается гуммозный стержень, после чего образуется гум­мозная язва. Этот процесс длится 3-4 мес, иногда сопровождаясь незначительными субъективными ощущениями. Невскрывшаяся гумма имеет плотную консистенцию, гладкую поверхность, слизистая оболочка над узлом умеренно воспалена, она имеет застойно-красную резко ограни­ченную окраску. После отделения стержня гуммозная язва имеет кратерообразную форму, плотные края, безболезненна, дно ее покрыто грануляци­ями. Язва постепенно заживает с образованием звездчатого втянутого руб­ца. При локализации на небе на месте гуммы нередко образуется перфора­ция, сохраняющаяся после разрешения процесса.

На твердом небе гумма обычно располагается по средней линии. Вслед­ствие того, что слизистая оболочка тонка и интимно связана с надкостни­цей неба начинающийся гуммозный процесс очень быстро переходит на периост и кость. Инфильтрат гуммы быстро распадается, и обнажается кость, которая некротизируется и секвестрируется, возникает сообщение между полостями рта и носа.

Лечение больного сифилисом может быть начато только после подтверждения клинического диагноза обнаружением бледных трепонем при первичном и вторичном сифилисе или положительными серологическими реакциями. Под влиянием противосифилитического лечения высыпания быстро исчезают, причем уже через 8-10 ч после начала пенициллинотера­пии бледные трепонемы не обнаруживаются на поверхности высыпаний. В связи с этим больные сифилисом через 10-12 ч после начала лечения пе­нициллином практически не заразны при бытовом контакте, а также при осмотре их врачами, в том числе стоматологами.

Стоматолог в своей практике может столкнуться с больным третичным си­филисом, у которого единственным проявлением заболевания могут оказать­ся гуммозные или бугорковые высыпания на слизистой оболочке рта. Лече­ние таких больных нельзя начинать с введения пенициллина, так как он вы­зовет реакцию обострения, которая будет стимулировать быстрое рассасыва­ние сифилитических высыпаний, что может привести к катастрофе, даже к смерти больного, если такие высыпания локализуются в жизненно важных органах. Это связано с тем, что при таком лечении рассасывание инфильтра­та произойдет за 2-3 дня, в течение которых не успеет образоваться замеща­ющая их соединительная ткань. В связи с этим лечение больных третичным сифилисом всегда следует начинать с приема йода в течение 2-4 нед, затем вводят половину курсовой дозы препарата висмута и лишь потом пеницил­лин, после чего вторую половину курсовой дозы препарата висмута; второй и последующие курсы лечения начинают, как обычно, т.е. с пенициллина.

Стоматолог может встретиться с больным, который перенес третичный или поздний врожденный сифилис и у которого имеется перфорация неба, требующая пластической операции. Следует иметь в виду, что больные си­филисом после окончания лечения 5 лет находятся на диспансерном учете, в течение этого времени у них определяют излеченность сифилиса. В свя­зи с этим пластическую операцию таким больным следует делать после снятия их с учета. Если же возникает необходимость в операции до этого срока, то оперативное вмешательство необходимо проводить под защитой пенициллина, в этом случае величину суммарной дозы препарата опреде­ляют коллегиально с венерологом, под наблюдением которого находится больной.

При лечении проявлений сифилиса в полости рта могут возникнуть ос­ложнения, связанные с применением пенициллина и препаратов висмута. Пенициллин и его препараты могут вызвать острый аллергический меди­каментозный стоматит, в связи с которым необходимо прекратить введе­ние пенициллина, и кандидоз. Последнее осложнение у больных сифили­сом не требует обязательной отмены пенициллина. Осложнениями от пре­паратов висмута являются висмутовая кайма, висмутовый гингивит и сто­матит.

В зависимости от локализации воспалительного процесса поражение слизистой оболочки полости рта называется различно: стоматит (слизистая щек), глоссит (язык), гингивит (десны), хейлит (губы). Стоматиты обычно являются либо следствием различных дистрофических процессов в организме, инфекционных или соматических заболеваний, либо результатом повреждающего физического или химического воздействия на слизистую при вторичной роли резидентной микрофлоры. При поверхностных катаральных стоматитах обычно обнаруживают Гр + аэробные кокки и палочки, при глубоких стоматитах преобладает строго анаэробная Гр - флора (фузобактерии, бактероиды, пептострептококки).

При язвенно-некротических стоматитах преобладает анаэробная флора, преимущественно фузобактерии и спирохеты, однако могут присутствовать и другие микроорганизмы (вейллонелы, пептострептококки, бактероиды, вибрионы, актиномицеты). К фузоспирохетозам также относят язвенно - некротическую ангину Венсана, ангину Людвига, гангрену легкого, язвенный колит и др.).

В последние годы отмечается рост заболеваемости кандидомикозом. Это связано с широким применением антибиотиков, кортикостероидов, цитостатиков. Длительное их применение приводит к нарушению состава нормальной микробной флоры (дисбактериоз). Грибы кандида являются резидентом слизистых оболочек полости рта, пищеварительного тракта, дыхательных путей, влагалища, кожных покровов.

Процесс взаимоотношения дрожжевых клеток с эпителиальными клетками слизистой оболочки рта начинается с их адгезии. Сахароза, мальтоза, глюкоза и другие углеводы повышают активность адгезии. Адгезивность дрожжеподобных грибов рода Candida во многом определяет их вирулентность.

Система комплемента, которая активизируется маннаном клеточной стенки дрожжей, ингибирует их адгезию. Дрожжеподобные грибы способствуют разрушению зубной эмали и развитию кариеса. Кариозные зубы, в которых вегетируют дрожжевые клетки, можно рассматривать, как своеобразную экологическую нишу-, благодаря которой они могут участвовать в развитии микотических тонзиллитов и стоматитов. Местные проявления кандидоза или первичный кандидоз в полости рта протекает в форме острого псевдомембранозного кандидоза (молочницы), острого или хронического кандидоза и гиперпластического кандидоза.

Тестовые задания:

Таксономическое положениевозбудителя сифилиса:


  1. класс;

  2. семейство;

Серологические реакции, применяемые при диагностике сифилиса:


  1. реакция Вассермана;

  2. осадочные;

Основной метод диагностики возвратных тифов:


  1. бактериоскопический;

  2. серологический;

  3. аллергический.

Методы окраски спирохет:


  1. Грама;

  2. Серебрение;

  3. Нейссера;

  4. Романовского-Гимзы;

  5. Гинса.

Материал для диагностикилептоспирозов:


  1. Кровь;

  2. Испражнения;

  3. Моча;

  4. Рвотные массы.
Этиология возвратного тифа:

  1. Риккетсии;

  2. Грибы;

  3. Боррелии;

  4. Вирусы;

  5. Микоплазмы.

^ СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ:

Задача 1. Мужчина 40 лет обратился к врачу на 8-ой день болезни. Несколько дней назад он купался в реке, выше по течению которой было место водопоя скота. Среди животных в данной местности регистрировались заболевания лептоспирозом. Врач заподозрил возможность лептоспироза.

Какой материал на данном этапе болезни необходимо взять у больного и с помощью какого микробиологического метода можно поставить диагноз?

Задача 2. У больного, обратившегося в кожно-венерологический диспансер, обнаружен твердых шанкр. Какое микробиологическое исследование позволит поставить диагноз сифилиса на данном этапе болезни?

Занятие № 11.

Тема занятия: «Микробиологическая диагностика микоплазмозов и хламидиозов».

План занятия:


  1. Морфологические и биологические свойства микоплазм и хламидий.

  2. Методы диагностики хламидиозов.

  3. Методы диагностики микоплазмозов.

  4. Тестовый контроль: «Патогенные спирохеты, микоплазмы, хламидии».

Хламидии и хламидиозы

При окрашивании по Романовскому-Гимзе они приобретают голубой или фиолетовый цвет. Однако хламидии хорошо видны и в неокрашенном состоянии при микроскопии влажных препаратов под стеклом с помощью фазовоконтрастной оптической системы. В оптимальных условиях роста в эукариотных клетках жизненный, цикл хламидий составляет 17-70 ч. Хламидии хорошо размножаются в желточном мешке куриных эмбрионов при температуре от 33 до 41 С (в зависимости от вида), а также в культурах клеток различных позвоночных.

Chlamydia pneumoniae

Респираторный хламидиоз – инфекционное заболевание, вызываемое хламидиями, проявляющееся в виде пневмонии (хламидийная пневмония), катара верхних дыхательных путей и общей интоксикации.

Возбудитель - Chlamydia pneumoniae - имеет родовой антиген, общий с антигенами других видов, белковый видоспецифический и, возможно, типоспецифические антигены. Жизненный цикл аналогичен циклу других хламидий, но элементарные тельца имеют не сферическую, а грушевидную форму, образующуюся за счет расширенного периплазматического пространства. Кроме того, С. pneumoniae не синтезируют гликоген в своих микроколониях. Хламидий этого вида скудно размно­жаются в желточных мешках куриных эмбрионов и в культурах клеток. Обладают выраженным тропизмом к эпителию дыхательных путей.

Болезнь широко распространена. Эпидемические вспышки отмечены во многих странах Западной Европы, Америки и в Австралии. Источником инфекции является больной человек. Возбудитель выделяется с отделяемым носоглотки. Механизм заражения - воздушно-капельный. Восприимчивость людей к возбудителю высокая, у детей и престарелых заболевание протекает в более тяжелой форме; у молодых людей - чаще в виде легких форм. Основная клиническая форма болезни - мелкоочаго­вая и (или) интерстициальная пневмония, выявляемая рентгенологически.

Лечение. Наиболее эффективны антибиотики: тетрациклины, макролиды, угнетающие размноже­ние возбудителя.

Лабораторная диагностика хламидиозов

Поскольку хламидиозы распространены глобально, а их клинические проявления очень разнообраз­ны, особое значение в диагностике этих заболеваний имеют лабораторные методы. В зависимости от формы болезни материалом для исследования служат: соскобы с конъюнктивы, экссудат из бубонов, смывы из носоглотки, уретры, материал, взятый тампоном со слизистой оболочки дыхательных, мочеполовых путей, мокрота, кровь (во время лихорадки), а также секционный материал (кусочки печени, селезенки, легких и других тканей).

^ Бактериологическая диагностика состоит из предварительного микроскопического исследова­ния материала, выделения возбудителя и его идентификации. Предварительное исследование заключа­ется в бактериоскопии с целью обнаружения хламидий в инфицированных клетках либо с помощью прямой или непрямой иммунофлуоресценции, либо с использованием фазово-контрастной оптики, либо с применением окраски по Романовскому-Гимзе. Для выделения возбудителя исследуемым материалом заражают культуры клеток (лучше всего L-929, McCoy, HeLa) или куриные эмбрионы. Для подавления роста бактерий исследуемый материал обрабатывают гентамицином, стрептомицином и канамицином. Зараженные культуры клеток инкубируют при 35-36 °С в течение 6 дней, а затем микроскопируют с помощью фазового контраста, иммунофлуоресценции, ставят пробу на гликоген и определяют принадлежность к роду Chlamydia с помощью РСК с групповым антигеном. РСК считает­ся положительной в разведении 1:8. При заражении куриных эмбрионов исследуют желточные мешки эмбрионов, погибших в течение 4-10 дней. При отсутствии бактериального загрязнения микроскопируют препараты, окрашенные по Романовскому-Гимзе, и определяют в суспензии из желточного мешка наличие группового антигена в РСК. В случае выделения C . trachomatis производят определение серотипа. Для этой цели сыворотку морской свинки, от которой выделен данный штамм, испытывают с прототипными антигенами известных 15 серотипов с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции.

Для обнаружения хламидий применяют также биологический метод - исследуемым материа­лом заражают белых мышей и морских свинок, так как некоторые штаммы C . psittaci патогенны для мышей, но не для свинок, и наоборот, некоторые штаммы C . trachomatis (серотипы А, В и С) не размножаются в организме мышей, но патогенны для свинок.

Новорожденные мыши погибают при внутримозговом их заражении через 5-10 дней от геморраги­ческого менингита, при интраназальном - через 5-10 дней от пневмонии. У мышей и свинок при внутрибрюшинном заражении увеличиваются печень, селезенка, а в брюшной полости образуется фибринозный экссудат. При микроскопическом исследовании у животных, зараженных разными спо­собами, обнаруживаются микроколонии хламидий в мононуклеарных клетках ликвора (при внутримоз­говом), легких (при интраназальном), селезенке, печени и в перитонеальном экссудате (при внутри-брюшинном заражении). В связи с тем, что С. pneumoniae плохо размножаются в культурах клеток и куриных эмбрионах, для их обнаружения и идентификации используют моноклональные антитела к видоспецифическому антигену в реакциях иммунофлуоресценции.

Для серологической диагностики пситтакоза (орнитоза) и венерического лимфогранулематоза применяют РСК и непрямую иммунофлуоресценцию. Комплементсвязывающие антитела появляются через 4-8 дней в небольшом количестве, затем титр их возрастает. Поэтому РСК лучше ставить с парными сыворотками. В связи с наличием у хламидий родового антигена специфичность и чувстви­тельность серологических реакций может быть повышена на основе использования моноклональных антител и выявленных с их помощью наиболее специфических для каждого вида (и серотипа) антигенов-диагностикумов.

Для диагностики хламидиозов могут быть использованы и внутрикожные аллергические пробы, но степень их специфичности зависит от степени специфичности аллергенов, так как могут быть перекрестные реакции за счет общих групповых антигенов.

Мир микроорганизмов чрезвычайно разнообразен и систематизирован учёными-исследователями. Изучение живого микромира активно велось в прошлом столетии. Однако, многие болезни до конца не изучены и в нынешнем веке.

Так, например, до сих пор не существует единого мнения по поводу происхождения сифилиса. Эта «французская болезнь», как наиболее древнее инфекционное заболевание человечества, по утверждению М. В. Милича, возникла на Земле одновременно с появлением человека.

К слову, М.В. Милич - ведущий сифилидолог страны периода 60-80-х годов, автора многочисленных книг и монографий, посвященных сифилису.

Официально открытие возбудителя сифилиса относится к 1905 году. Немецкие микробиологи Ф. Шаудин и Э. Гофман определили ряд морфологических, культуральных, биохимических свойств бледной трепонемы, а также некоторые особенности данного микроорганизма, положенные в основу таксономии.

В данной статье подробно разберем особенности строения, антигенную структуру, биохимические и физиологические свойства инфекционного агента, вызывающего сифилис.

Итак, единственным возбудителем сифилиса человека является Treponema pallidum (бледная трепонема). Она относится к порядку Spirochaetales типа Spirochaetes.

    Показать всё

    1. Морфология Treponema pallidum

    Клетки бледных трепонем имеют длину 6-15 мкм, ширину 0,1-0,2 мкм, представляют собой протоплазматический цилиндр (цитоплазма, окружённая цитоплазматической мембраной), скрученный в спираль. Иногда клетка микроорганизма напоминает штопорообразную тонкую нить.

    Рисунок 1 - Строение бледной трепонемы. OM, наружная мембрана; Ef (эндофлагелла или периплазматические жгутики); LP 1, 2, липопротеины; Pg - пептидогликан; CM - цитоплазматическая мембрана. (Из Cox DL, Chang P, McDowall AW и Radolf JD: Наружная мембрана, а не оболочка белков хозяина, ограничивает антигенность вирулентной трепонемы паллидум. Infect Immun 60: 1076)

    Число завитков - от 8 до 14 штук. Завитки, одинаковые по размерам, сохраняются при любых движениях клетки, даже при движении трепонемы вдоль или между других клеток, например, форменных элементов крови.

    Рисунок 2 - Электронная микрофотография Treponema pallidum. (From Fitzgerald TJ, Cleveland P, Johnson RC et al: Сканирующая электронная микроскопия Treponema pallidum (штамм Nichols), прикрепленная к культивируемым клеткам млекопитающих. J Bacteriol 130: 1333, 1977.)

    С полюсов клетки, между оболочкой и цитоплазмой располагаются фибриллы. Одна часть фибриллы зафиксирована, вторая часть остаётся свободной. Фибриллы образуют двигательный аппарат трепонемы паллидум, позволяющий осуществлять несколько типов движения в жидкой среде:

    1. 1 Перемещение.
    2. 2 Вращение вдоль оси.
    3. 3 Сгибание.

    Treponema pallidum является грамотрицательным микроорганизмом. Однако, по Грамму не окрашивается, так как имеет в своём составе гидрофобные частицы, не восприимчивые к анилиновым красителям.

    При окраске по Романовскому-Гимзе приобретает слабо – розовый цвет. Эта особенность послужила основанием для видового названия возбудителя сифилиса.

    Treponema pallidum subsp pallidum - это требовательный к условиям окружающей среды микроорганизм, который имеет узкие оптимальные диапазоны pH (7,2-7,4), Eh (-230-240 мВ) и температуру (30-37°C). Трепонемы быстро инактивируются слабым теплом, холодом, высушиванием и большинством дезинфицирующих средств.

    Традиционно трепонемы паллидум считались строгими анаэробами, но теперь они известны как микроаэрофильные бактерии.

    2. Культуральные и биохимические свойства

    Несмотря на интенсивные усилия в течение последних 75 лет, T pallidum pallidum не были успешно культивированы in vitro. Жизнеспособные микроорганизмы могут сохраняться в течение 18-21 дней в комплексных средах, а ограниченная репликация была получена совместным культивированием с клетками культуры ткани. Другие три патогенных вида трепонем также не были успешно выращены in vitro.

    При культивации бледная трепонема теряет свою патогенность, но, тем не менее, сохраняет некоторые антигенные свойства (эту особенность используют для постановки реакции Вассермана).

    Культуру, в основном, культивируют в тестикулах кроликов. В ткани тестикул трепонема паллидум размножается, вызывая орхит у многострадальных животных.

    Размножается Т. pallidum бинарным поперечным делением при температуре около 37˚С. Время генерации in vivo относительно велико (30 часов).

    Трепонемы малоустойчивы во внешней среде.

    1. 1 Вне человеческого организма живут несколько минут, после высыхания погибают. Так, при температуре 40˚С трепонемы погибают в течение нескольких часов, при температуре свыше 50˚С - в течение 15 минут.
    2. 2 При неблагоприятных условиях микроорганизм образует L–формы, а также цисты, которые, в свою очередь, способны, к образованию вновь спиралевидных форм.

    По типу метаболизма Т. pallidum является хемоорганогетеротрофом. Это означает, что в качестве источника энергии для жизнедеятельности бледная трепонема использует органические вещества и энергию химических связей.

    Ввиду неспособности к существованию Т. pallidum in vitro биохимические свойства изучены не достаточно хорошо.

    3. Антигенная структура

    Т. pallidum имеет мало изученную антигенную структуру. Она представлена специфическим термолабильным протеиновым антигеном, неспецифическим липоидным антигеном, а также антигеном полисахаридной природы.

    Проще говоря, антигены бледной трепонемы – это преимущественно белки, липиды и полисахариды наружной мембраны клетки.

    Важную роль играет липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерии. Он выполняет антигенную и токсическую функции, являясь эндотоксином бледной трепонемы.

    Липоидный антиген сходен с тканевым экстрактом бычьего сердца – кардиолипином.

    4. Факторы патогенности

    Как и биохимические свойства, факторы патогенности трепонем изучены не достаточно хорошо.

    После попадания в макроорганизм Т. pallidum высвобождает специфические белки, липополипротеины и липополисахариды, проявляющие токсические свойства после ее гибели.

    Липополипротеины участвуют в активации иммунной системы, а протеины сходны по отдельным свойствам с бактериальными гемолизинами.

    К факторам патогенности бледной трепонемы относят способность высвобождать эндотоксины и липидные антигены по все видимости, из липидов митохондриальных мембран, обладающие свойством аутоантигенов.

    Т. pallidum, являясь грамотрицательной бактерией, не продуцирует экзотоксины, однако обладает токсической активностью в отношении некоторых клеток, например, нейробластов.

    5. Виды иммунитета

    В ответ на внедрение возбудителя сифилиса в организм человека возникает клеточный и гуморальный иммунный ответ.

    Клеточный иммунитет связан с фиксацией бледной трепонемы к клеткам органов и тканей и последующей активацией макрофагов, Т-лимфоцитов. При этом из организма человека возбудитель сифилиса не элиминируется.

    Гуморальный иммунитет характеризуется образованием специфических иммуноглобулинов. На ранних этапах инфекции в организме человека образуются IgM. По мере прогрессирования инфекции активируется синтез IgG. IgA синтезируется в малых количествах. Вопросы участия и синтеза IgD и IgE не достаточно хорошо изучены.

    6. Чувствительность к антибактериальным препаратам

    Возбудитель сифилиса чувствителен практически ко всем антибиотикам, но к препаратам выбора относятся пенициллины.

    В основе клеточной стенки бледной трепонемы лежит пептидогликан, выполняющий защитную функцию. Этот пептидогликан является «мишенью» для основного антибактериального препарата, предназначенного для лечения сифилиса – пенициллина. Антибиотики группы пенициллинов разрывают тетрапептидные связи пептидогликана.

    При воздействии антибиотика на растущую бледную трепонему (возможно, при длительном воздействии) образуется L-форма бактерии. Такая форма лишена клеточной стенки, но всё ещё способна к размножению.

    Определение чувствительности бледной трепонемы к антибактериальным препаратам не проводится.

    7. Лабораторная диагностика сифилиса

    Лабораторные методы диагностики сифилиса условно можно разделить на 2 группы:

    1. 1 Выявление самого возбудителя заболевания из биологических препаратов (содержимое шанкра, гнойное отделяемое папул, пунктаты из лимфатических узлов).
    2. 2 Серологические реакции.

    Серологические реакции используются как для верификации диагноза, так и для оценки эффективности терапии сифилиса. Особенность серологии сифилиса сводится к отсутствию положительных результатов анализов на раннем этапе заболевания.

    Объясняется это достаточно просто. Так, инкубационный период сифилиса в среднем составляет 3-5 недель. Было замечено, что у асоциальных лиц, злоупотребляющих спиртным, а также у лиц с туберкулёзом и ВИЧ-инфекцией инкубационный период отличается от средних показателей в сторону уменьшения (2 недели).

    Инкубационный период увеличивается на фоне приёма различных антибактериальных препаратов (до 6 месяцев).

    На протяжении этого времени концентрация антител не успевает достигнуть диагностического титра. Однако, у инфицированного человека могут присутствовать клинические симптомы. Такой сифилис называется серонегативным.

    Серопозитивным называют сифилис с яркой клинической картиной и присутствием в крови диагностического титра антитела (то есть положительный результат серологических реакций). При отсутствии лечения серопозитивный сифилис перетекает во вторичный сифилис, длящийся несколько лет.

    8. Выявление T. pallidum в субстрате

    8.1. Методика исследования Т. pallidum в «тёмном поле»

    Популярным методом диагностики является обнаружение бледной трепонемы в тёмном поле микроскопа. Этот метод позволяет наблюдать за трепонемой, учитывать особенности её морфологии и движения.

    Материал для исследования забирают с твердого шанкра или с эрозий гранулём и папул. Осторожно захватывают предварительно очищенный материал петлей, смешивают с каплей физиологического раствора и наносят на предметное стекло.

    Живой материал изучают в тёмном поле микроскопа. Для этого применяют специальный конденсор, позволяющий изучать трепонему «во всей красе».

    8.2. Микроскопия мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе

    Для исследования фиксированных (сухих) мазков используется метод окрашивания по Романовскому-Гимзе. При таком окрашивании другие виды трепонем приобретают фиолетовый оттенок, а Т. pallidum - бледно-розовый цвет.

    Остальные методы исследования, такие как способ Бури, серебрение по Морозову, простой фуксиновый метод и др., не получили широкого практического применения, ввиду малой информативности.

    9. Серодиагностика

    Выявление антител к бледной трепонеме проводится для:

    1. 1 Подтверждения клинического диагноза сифилиса;
    2. 2 Установления диагноза скрытого сифилиса;
    3. 3 Контроля за эффективностью проводимого лечения;
    4. 4 Подтверждения выздоровления больных сифилисом;
    5. 5 Профилактика сифилиса и диспансеризация населения (исследование крови определённых категорий людей, например, относящихся к группам риска).

    Современные методы серодиагностики основаны на выявлении специфических и неспецифических антител разных классов.

    9.1. Неспецифические серологические реакции

    Лабораторное исследование крови проводится на предмет обнаружения противолипидных антител.

    • Реакция Вассермана (РВ, RW)

    Является классической неспецифической реакцией. В её основе лежит принцип связывания комплемента. Проводится реакция с двумя-тремя антигенами. Исполняется как для количественного, так и для качественного определения неспецифических антител.

    RW ставится с кардиолипиновым и трепонемным антигеном. Последний позволяет повысить специфичность реакции и оценить состояние иммунитета больного.

    При первичном сифилисе RW имеет положительное значение в конце инкубационного периода, т.е. через примерно 4 недели от начала заболевания.

    При исследовании больных вторичным сифилисом положительная RW выявляется у 100% больных и у 75% больных в стадии третичного сифилиса.

    Нередко, RW даёт ложноположительные результаты. Они имеют место быть при следующих физиологических состояниях:

    1. 1 При других инфекциях, вызванных вирусами, бактериями, простейшими;
    2. 2 При злокачественных опухолевых процессах;
    3. 3 При коллагенозах;
    4. 4 При беременности на поздних сроках (после 30 недели) и после родов;
    5. 5 У здоровых лиц, употребляющих спиртные напитки, а также после приёма жирной пищи.
    • Реакции, основанные на агглютинации кардиолипина (MP - RPR, VDRL)

    Эти реакции являются методом экспресс-диагностики сифилиса. По своему существу, это микрореакции, проводимые с плазмой крови (наиболее чувствительный метод) и инактивированной сывороткой (второй по чувствительности).

    Они проводятся капельным способом и требуют использование специального антигена. Этот метод серодиагностики проводится для отбора положительных проб с дальнейшим исследованием лиц с помощью специфических реакций.

    9.2. Специфическая серодиагностика

    В основе диагностики представлены различные методы обнаружения специфических антител.

    9.2.1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

    Занимает срединное положение из всех специфических методов серодиагностики. Реакция основана на принципах идентификации методом люминесцентной микроскопии флюоресцирующего комплекса, связанного с иммуноглобулином организма человека на поверхности клетки-патогена.

    Флюоресцирующий комплекс состоит из человеческого глобулина и флюоресцеин тиоизоционата. Существует несколько модификаций этой реакции:

    1. 1 Реакция иммунофлюоресценции с адсорбцией;
    2. 2 Реакция IgМ – РИФ с адсорбцией.

    9.2.2. Реакция иммобилизации Treponema pallidum (РИБТ)

    Реакция РИБТ основана на особенности заражённой сыворотки крови людей обездвиживать бледные трепонемы.

    В общих чертах методику можно объяснить так: в кровь больного добавляют антиген, приготовленный из сифиломы кролика и комплемент.

    Иммобилизирующие антитела - это поздние антитела. Своего максимума они достигают к концу первого года болезни. Этот метод не применяется при первичном серонегативном сифилисе, считается наиболее трудоёмким.

    9.2.3. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

    Данный метод диагностики автоматизирован. По чувствительности и специфичности сходен с реакцией иммунофлюоресценции с адсорбцией.

    9.2.4. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

    На фоне других серологических исследований, РНГА отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, особенно при использовании высококачественного антигена.

    Принцип реакции основан на агглютинации эритроцитов, несущих на своей поверхности антигены бледной трепонемы, если к ним добавить специфические антитела. Результат РПГА будет положительным уже в конце инкубационного периода, т. е. через 3-4 недели.

    Учитывая все особенности возбудителя сифилиса, можно выделить мероприятия, направленные на защиту здорового человека от заражения сифилисом.

    Так как заболевание передаётся половым и контактным (бытовой сифилис) путями, стоит знать, что эффективными способами защиты являются барьерная контрацепция и соблюдение общих правил гигиены.

При первичном сифилисе исследуется на бледную трепонему отделяемое твердого шанкра или пунктат лимфатических узлов. При вторичном сифилисе материал берется с поверхности эрозированных папул на коже, слизистых, с трещин и др. Перед взятием материала с целью очищения от различных загрязнений поверхность очагов (эрозии, язвы, трещины) необходимо тщательно протереть стерильным ватно-марлевым тампоном, который смачивается изотоническим раствором хлорида натрия или назначить примочки с этим же раствором. Очищенную поверхность осушивают сухим тампоном и платиновой петлей или лопаточкой слегка раздражают периферические участки, одновременно слегка сдавливая пальцами в резиновой перчатке основание элемента до появления тканевой жидкости (серума), из которой готовят препарат для исследования. Получение тканевой жидкости имеет важное значение для диагностики сифилиса, так как бледные трепонемы находятся в просветах лимфатических капилляров, в тканевых щелях вокруг лимфатических и кровеносных сосудов.

Пункция регионарных лимфатических узлов

Кожу над лимфатическими узлами обрабатывают 96% спиртом и 3-5% спиртовым раствором йода. Затем 1 и 2 пальцами левой кисти фиксируют лимфатический узел. Правой рукой берут стерильный шприц с несколькими каплями изотонического раствора хлорида натрия, который вкалывается параллельно продольной оси лимфатического узла. Игла проталкивается в разных направлениях до противоположной стенки капсулы узла и содержимое шприца медленно вводится. Пальцами левой кисти лимфатический узел слегка массируется. При медленном извлечении иглы одновременно выдвигают поршень шприца, аспирируя содержимое лимфатического узла. Материал наносится на предметное стекло (при малом количестве материала добавляется капля изотонического раствора хлорида натрия), покрывается покровным стеклом. Исследование нативного препарата проводится в темном поле зрения при помощи светооптического микроскопа с темнопольным конденсором (объектив 40, 7х, 10х или 15х). Бледные трепонемы могут обнаруживаться также в окрашенных препаратах. При окраске по Романовскому-Гимзе бледные трепонемы окрашиваются в розовый цвет, по Фонтану и Морозову в коричневый (черный), по методу Бурри неокрашенные трепонемы выявляются на темном фоне.

Серологическая диагностика

Важное значение в диагностике сифилиса, оценке эффективности лечения, установлении критерия излеченности, выявления скрытых, резистентных форм придается стандартным (классическим) и специфическим серологическим реакциям. К стандартным или классическим серологическим реакциям (КСР) относятся:
  • Реакция Вассермана (РВ),
  • осадочные реакции Кана и Закса-Витебского (цитохолевая),
  • реакция на стекле (экспресс-метод),
к специфическим:
  • реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ),
  • реакция иммунофлюоресценции (РИФ).

Реакция Вассермана (РВ)

- разработана А.Вассерманом (A.Wasserman) совместно с А.Нейссером (A.Neisser) и Ц.Бруком (C.Bruck) в 1906 году. Реакции Вассермана основана на феномене связывания комплемента (реакция Борде-Жангу) и позволяет определять противолипидные антитела (реагины). Согласно современным представлениям, в реакции Вассермана определяются антитела к липидам макроорганизма, а не бледной трепонемы и реакция выявляет аутоиммунный процесс, который вызывается денатурированием бледными трепонемами тканей макроорганизма с образованием липопротеидного комплекса (конъюгата), в котором липиды (гаптены) являются детерминантой.

Обычно РВ ставится с двумя или тремя антигенами. Наиболее часто применяется отличающийся высокой чувствительностью кардиолипиновый антиген (экстракт из сердца быка, обогащенный холестерином и лецитином) и трепонемный антиген (обработанная ультразвуком взвесь анатогенных культуральных бледных трепонем). Совместно с реагинами сыворотки крови больного эти антигены образуют иммунный комплекс, способный адсорбировать и связывать комплемент. Для визуального определения образованного комплекса (реагины + антиген + комплемент) в качестве индикатора применяется гемолитическая система (смесь эритроцитов барана с гемолитической сывороткой). Если комплемент связан в 1 фазе реакции (реагины + антиген + комплемент), гемолиз не наступает - эритроциты выпадают в легко заметный осадок (РВ положительная). Если в 1 фазе комплемент не связан вследствие отсутствия в испытуемой сыворотке реагинов, он будет использован гемолитической системой и произойдет гемолиз (РВ отрицательная). Степень выраженности гемолиза при постановке РВ оценивается плюсами: полное отсутствие гемолиза ++++ или 4+ (РВ резкоположительная); едва начавшийся гемолиз +++ или 3+ (РВ положительная); значительный гемолиз ++ или 2+ (РВ слабоположительная); непонятная картина гемолиза ± (РВ сомнительная); полный гемолиз - (реакция Вассермана отрицательная).

Помимо качественной оценки РВ имеется количественная постановка с различными разведениями сыворотки (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Титр реагинов определяется максимальным разведением, еще дающим резко положительный (4+) результат. Количественная постановка РВ имеет значение в диагностике некоторых клинических форм сифилитической инфекции, а также при проведении контроля за эффективностью лечения. В настоящее время реакция Вассермана ставится с двумя антигенами (кардиолипиновый и трепонемный озвученный штамм Рейтера). Как правило, РВ становится положительной на 5-6 неделе после заражения у 25-60% больных, на 7-8 неделе - у 75-96%, на 9-19 неделе - у 100%, хотя в последние годы иногда раньше или позже. При этом, титр реагинов постепенно нарастает и достигает максимальной величины (1:160-1:320 и выше) в случае появления генерализованных высыпаний (сифилис вторичный свежий). При позитивации РВ выставляется диагноз первичного серопозитивного сифилиса.
При вторичном свежем и вторичном рецидивном сифилисе РВ положительная у 100% больных, но у истощенных больных с ослабленным иммунитетом может наблюдаться отрицательный результат. Впоследствии титр реагинов постепенно понижается и при вторичном рецидивном сифилисе обычно не превышает 1:80-1:120.
При третичном сифилисе РВ положительная у 65-70% больных и обычно наблюдается низкий титр реагинов (1:20-1:40). При поздних формах сифилиса (сифилис внутренних органов, нервной системы) положительная РВ наблюдается в 50-80% случаев. Титр реагинов колеблется от 1:5 до 1:320.
При скрытом сифилисе положительная РВ отмечается у 100% больных. Титр реагинов от 1:80 до 1:640, а при позднем скрытом сифилисе от 1:10 до 1:20. Быстрое снижение титра реагинов (вплоть до полной негативации) во время лечения свидетельствует об эффективности лечения.

Недостатки реакции Вассермана - недостаточная чувствительность (в начальной стадии первичного сифилиса отрицательная). Она негативная также у 1/3 больных, если они в прошлом лечились антибиотиками, у пациентов третичным активным сифилисом с поражениями кожи и слизистых, костно-суставного аппарата, внутренних органов, центральной нервной системы, при позднем врожденном сифилисе.
Недостаточная специфичность - реакция Вассермана может быть положительная у лиц, которые ранее не болели и не болеют сифилисом. В частности ложноположительные (неспецифические) результаты РВ отмечаются у больных, которые страдают системной красной волчанкой, лепрой, малярией, злокачественными новообразованиями, поражениями печени, обширными инфарктами миокарда и другими заболеваниями, а иногда у совершенно здоровых людей.
Кратковременная ложноположительная реакция Вассермана выявляется у некоторых женщин перед родами или после них, у лиц, злоупотребляющих наркотиками, после наркоза, приема алкоголя. Как правило, ложноположительная РВ выражена слабо, чаще с низким титром реагинов (1:5-1:20), положительная (3+) или слабо положительная (2+). При массовых серологических обследованиях частота ложноположительных результатов составляет 0,1-0,15%. Для преодоления недостаточной чувствительности, пользуются постановкой на холоде (реакция Колляра) и одновременно она ставится с другими серологическими реакциями.

Осадочные реакции Кана и Закса-Витебского

Реакция Вассермана применяется в комплексе с двумя осадочными реакциями (Кана и Закса-Витебского ), при постановке которых готовятся более концентрированные антигены. Экспресс метод (микрореакция на стекле) - относится к липидным реакциям и основан на реакции преципитации. Ставится со специфическим кардиолипиновым антигеном, 1 каплю которого смешивают с 2-3 каплями исследуемой сыворотки крови в лунках специальной стеклянной пластины.
Преимущество - быстрота получения ответа (через 30-40 мин). Результаты оцениваются по количеству выпавшего осадка и величины хлопьев. Выраженность определяют как КСР - 4+, 3+, 2+ и отрицательная. Следует отметить, что ложноположительные результаты наблюдаются чаще, чем при РВ. Как правило, экспресс-метод применяется при массовых обследованиях на сифилис, при обследовании в клинико-диагностических лабораториях, соматических отделениях и больницах. На основании результатов экспресс-метода диагноз сифилиса выставлять запрещается, исключается его применение у беременных, доноров, а также для контроля после лечения.

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ)

Реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ) - предложена в 1949 году Р.Нельсоном (R.W.Nelson) и М.Мейером (M.Mayer). Является наиболее специфичным диагностическим тестом на сифилис. Однако сложность и дороговизна постановки ограничивает ее применение. В сыворотке крови больных производится определение видеоспецифичных антител (иммобилизинов), которые приводят к неподвижности бледных трепонем в присутствии комплемента. Антигеном являются живые патогенные бледные трепонемы, выделяемые от зараженных сифилисом кроликов. С помощью микроскопа проводится посчет утративших подвижность (иммобилизованных) бледных трепонем и оцениваются результаты РИБТ: иммобилизация бледных трепонем от 51 до 100% - положительная; от 31 до 50% - слабо положительная; от 21 до 30% - сомнительная; от 0 до 20% - отрицательная.
РИБТ имеет значение при дифференциальной диагностике для отграничения ложноположительных серологических реакций от реакций, обусловленных сифилисом. Поздно становится положительной чем РВ, РИФ и поэтому для диагностики заразных форм сифилиса ее не применяют , хотя во вторичном периоде сифилиса она положительная у 85-100% больных.
В третичном периоде сифилиса с поражением внутренних органов, опорно-двигательного аппарата, нервной системы РИБТ положительная в 98-100% случаев (РВ часто отрицательная ).
Необходимо помнить, что РИБТ может оказаться ложноположительной в случае наличия в исследуемой сыворотке трепонемоцидных препаратов (пенициллин, тетрациклин, макролиты и др.), которые вызывают неспецифическую иммобилизацию бледных трепонем. С этой целью кровь на РИБТ исследуется не ранее 2 недель после окончания приема антибиотиков и других лекарственных средств.
РИБТ как и РИФ в процессе лечения медленно негативируются, поэтому она не применяется в качестве контроля в процессе лечения.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) - разработана в 1954 году A.Coons и впервые применена для диагностики сифилитической инфекции Deacon, Falcone, Harris в 1957 году. РИФ основана на непрямом методе определения флюоресцирующих антител. Антигеном для постановки являются фиксированные на предметных стеклах тканевые патогенные бледные трепонемы, на которые наносят исследуемую сыворотку. Если в исследуемой сыворотке имеются противотрепонемные антитела, относящиеся к IgM и IgG, они прочно связываются с антигеном - трепонемами, что выявляется в люминесцентном микроскопе с помощью антивидовой ("противочеловеческой") флюоресцирующей сыворотки.
Результаты РИФ учитываются по интенсивности свечения бледных трепонем в препарате (желто-зеленое свечение). При отсутствии противотрепонемных антител в сыворотке, бледные трепонемы не определяются. При наличии антител выявляется свечение бледных трепонем, степень которого выражается в плюсах: 0 и 1+ - отрицательная реакция; от 2+ до 4+ - положительная.
РИФ относится к групповым трепонемным реакциям и ставится в разведении исследуемой сыворотки в 10 и 200 раз (РИФ-10 и РИФ-200). РИФ-10 считается более чувствительной, однако часто выпадают неспецифические положительные результаты, чем при постановке РИФ-200 (отличается более высокой специфичностью). Как правило, РИФ становится положительной раньше, чем РВ - положительная при первичном серонегативном сифилисе у 80% больных, у 100% во вторичном периоде сифилиса, всегда положительная при скрытом сифилисе и в 95-100% случаев при поздних формах и врожденном сифилисе.
Специфичность РИФ повышается после предварительной обработки исследуемой сыворотки сорбентом-ультраозвученным трепонемным антигеном, который связывает групповые антитела (РИФ - абс).
Показания к постановке РИБТ и РИФ - диагностика скрытого сифилиса для подтверждения специфичности комплекса липидных реакций в случае предположения сифилитической инфекции на основании положительной РВ. Положительные РИБТ и РИФ являются доказательством латентного сифилиса. При ложноположительной РВ при различных болезнях (системная красная волчанка, злокачественные новообразования и др.) и если повторные результаты РИБТ и РИФ отрицательные, это свидетельствует о неспецифическом характере РВ. Подозрение на поздние сифилитические поражения внутренних органов, опорно-двигательного аппарата, нервной системы при наличии у больных отрицательной РВ. Подозрение на первичный серонегативный сифилис, когда у пациентов при многократных исследованиях отделяемого с поверхности эрозии (язвы), при пунктате из увеличенных регионарных лимфатических узлов бледная трепонема не обнаруживается - в этом случае ставится только РИФ - 10.
При обследовании лиц с отрицательной РВ , которые имели длительные половые и бытовые контакты с больными сифилисом, учитывая вероятную возможность лечения их в недавнем прошлом противосифилитическими препаратами, вызвавшими негативацию РВ. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA - enzymelinked immunosorbent assay) - метод разработан E.Engvall и соавт., S.Avrames (1971). Сущность состоит в соединении сифилитического антигена, сорбированного на поверхности твердофазного носителя с антителом исследуемой сыворотки крови и выявлении специфического комплекса антиген-антитело при помощи меченной ферментом антивидовой иммунной сыворотки крови. Это позволяет оценивать результаты ИФА визуально по степени изменения окраски субстрата под действием фермента, входящего в состав конъюгата. Недостоверные результаты ИФА могут возникать в результате недостаточного разведения инградиентов, нарушения температурного и временного режимов, несоответствии рН растворов, загрязнении лабораторной посуды, неправильной технике промывки носителя.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Предложена в качестве диагностического теста на сифилис T.Rathlev (1965,1967), T.Tomizawa (1966). Макромодификация реакции называется ТРНА, микромодификация - МНА-ТР, автоматизированный вариант - AMNA-TR, реакция с макрокапсулами из полимочевины вместо эритроцитов - МСА-ТР. Чувствительность и специфичность РПГА аналогичны РИБТ, РИФ, но РПГА имеет меньшую чувствительность при ранних формах сифилиса по сравнению с РИФ-абс и большую при поздних, при врожденном сифилисе. РПГА ставится в качественном и количественном вариантах.

Техника взятия крови для серологических реакций

Для исследования на РВ, РИФ, РИБТ кровь берут из локтевой вены натощак или не раньше 4 час после приема пищи стерильным шприцом или одной иглой (самотеком). В месте взятия кожу предварительно обрабатывают 70% спиртом. Шприц и игла должны быть промыты изотоническим раствором хлорида натрия. В чистую сухую холодную пробирку вливают 5-7 мл исследуемой крови. На пробирку клеится чистая бумага с фамилией, инициалами пациента, номером истории болезни или амбулаторной карты, датой взятия крови. После взятия крови пробирка помещается в холодильник с температурным режимом +4°+8°С до следующего дня. На следующий день сыворотка сливается для исследования. В случае не использования крови на следующий день, сыворотку необходимо слить со сгустка и хранить в холодильнике не более 1 недели. Для исследования на РИБТ пробирка должна быть специально подготовлена и стерильна. В случае нарушения правил забора крови на исследование, несоблюдение условий может произойти искажение результатов.
Не рекомендуется производить забор крови для исследования после приема пищи, алкоголя, различных медикаментозных препаратов, после введения различных вакцин, во время менструального цикла у женщин.
Для исследования на экспресс-метод кровь берегся из кончика пальца, как это делается при ее взятии на СОЭ, но берут кровь на 1 капилляр больше. Экспресс-метод можно также ставить с сывороткой крови, полученной при помощи венопункции. Если возникает необходимость исследования крови в отдаленных лабораториях, вместо крови можно пересылать сухую сыворотку (метод сухой капли). Для этого на следующий день после взятия крови, сыворотку отделяют от сгустка и набирают в стерильный шприц в количестве 1 мл. Затем сыворотку выливают в виде 2 отдельных кружков на полоску плотной писчей бумаги (вощаная бумага или целлофан) размером 6x8 см. На свободном крае бумаги пишется фамилия, инициалы обследуемого и дата забора крови. Бумагу с сывороткой защищают от прямых солнечных лучей и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Сыворотка засыхает в виде небольших кружочков блестящей желтоватой стекловидной пленки. После этого, полоски бумаги с высушенной сывороткой свертывают как аптечный порошок и отсылают в лабораторию, указывая диагноз и с какой целью исследуется.

Серологическая резистентность

У части (2% и более) больных сифилисом, несмотря на проведенную полноценную противосифилитическую терапию, наблюдается замедление (отсутствие) негативации серологических реакций после окончания лечения до 12 мес и более. Возникает так называемая серологическая резистентность, которая в последние годы стала часто наблюдаться. Различают формы серологической резистентности:
  • Истинная (абсолютная, безусловная) - необходимо провести дополнительное противосифилитическое лечение, комбинируя с неспецифической терапией для повышения иммунных сил организма.
  • Относительная - после полноценного лечения бледные трепонемы образуют цист- или L-формы, которые находятся в организме в маловирулентном состоянии и вследствие этого дополнительное лечение не изменяет показатели серологических реакций, особенно РИФ и РИБТ.
В то же время в цист-формах происходят незначительные обменные процессы, а оболочки цист-форм являются чужеродным белком (антигеном). Для своей защиты организм вырабатывает специфические антнтела, которые положительны или резко положительны при постановке серологических реакций, отсутствии проявлений заболевания. При L-формах обменные процессы более снижены и антигенные свойства отсутствуют или незначительно выражены. Специфические антитела не вырабатываются или они в небольшом количестве, серологические реакции слабо положительные или отрицательные. Чем больший период времени от момента заражения, тем большее количество бледных трепонем трансформируется в формы выживания (цисты, споры, L-формы, зерна), при которых противосифилитическая терапия не эффективна.

Псевдорезистентность - после проведенного лечения несмотря на положительные серологические реакции бледная трепонема в организме отсутствует. Антигена в организме нет, но продолжается выработка антител, которые фиксируются при постановке серологических реакций.
Серологическая резистентность может развиваться вследствие:

  • неполноценного лечения без учета давности и стадии заболевания;
  • недостаточной дозы и в частности из-за неучета массы тела пациентов;
  • нарушения интервала между введением препаратов;
  • сохранения в организме бледных трепонем несмотря на проведенное полноценное специфическое лечение, из-за их стойкости к пенициллину и другим химиопрепаратам в случае наличия скрытых, осумкованных очагов поражения во внутренних органах, нервной системе, лимфатических узлах, которые малодоступны для антибактериальных препаратов (нередко бледные трепонемы обнаруживаются в тканях рубца через много лет после окончания терапии, в лимфатических узлах иногда удается обнаружить бледные трепонемы через 3-5 лет после противосифилитической терапии);
  • снижения защитных сил при различных заболеваниях и интоксикациях (эндокринопатии, алкоголизм, наркомания и др.);
  • общего истощения (приемом пищи бедной витаминами, белками, жирами).
Кроме этого, нередко выявляется ложная позитивация серологических реакций, не связанная с наличие у больных сифилиса и вызванная:
  • сопутствующими неспецифическими заболеваниями внутренних органов, нарушениями сердечнососудистой системы, ревматизмом, дисфункциями эндокринной и нервной систем, тяжелыми хроническими дерматозами, злокачественными новообразованиями;
  • поражениями нервной системы (тяжелые травмы, сотрясение головного мозга, психические травмы);
  • беременностью; хроническими интоксикациями алкоголем, никотином наркотиками; инфекционными болезнями (малярия, туберкулез, вирусный гепатит, дизентерия, сыпной, брюшной и возвратный тифы).
Указанные факторы могут оказывать влияние на иммунологическую реактивность организма как в период активного развития сифилитических проявлений, так и во время их регресса.